一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种干细胞在疾病治疗中的应用，特别涉及经血来源的间充质干细胞 在治疗肝纤维化中的应用。
【背景技术】
[0002] 肝纤维化是多数终末期肝病的病理特征之一，肝纤维化若得不到有效治疗，最终 将会发展为肝硬化、肝癌，严重威胁患者生命。肝纤维化的本质是细胞外基质中胶原合成增 多、降解减少，致使细胞外基质过多沉积于肝内，影响肝脏的正常功能。目前认为肝纤维化 形成的机制在于，肝细胞损伤和肝组织炎症，激活了枯否氏（Kupffer)细胞、肝细胞、血小 板或窦内皮细胞分泌细胞因子、脂质过氧化物等，这些化学递质共同作用于肝星状细胞，使 之转变为肌纤维母细胞，合成大量的胶原和蛋白多糖等细胞外基质沉积引起肝纤维化。
[0003] 肝纤维化的治疗主要集中在纤维化过程的延缓和逆转，以及阻止功能性肝细胞减 少两个方面。肝脏移植被认为是目前治疗肝纤维化的有效方法之一，但由于肝源不足、移植 费用昂贵、手术风险高以及移植后并发症严重等原因的限制，肝脏移植难以大范围推广。生 物人工肝虽然能够在一定程度上替代肝脏的部分代谢功能，但同样存在人工肝解毒能力有 限、异体排斥反应、体外细胞培养受限等问题，并不能根除功能性肝细胞减少造成的病理症 状。
[0004] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC)是一类具有多分化潜能、免疫调 节功能的成体干细胞，间充质干细胞容易分离培养，便于体外扩增，能分泌多种细胞因子， 研宄表明间充质干细胞在一定程度上可以延缓和逆转肝纤维化，再生肝细胞，为肝纤维化 的临床治疗提供新思路。在已分离培养的各类间充质干细胞中，骨髓间充质干细胞因其数 量和增殖分化潜能随供体年龄增大而下降，且在分离培养过程中易受病毒感染，直接影响 其安全性，制约了大规模使用。尽管脐带血间充质干细胞的安全性可以得到保证，但其数量 少，频率低，培养方案不统一，传代培养困难，不易大量获得。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种数量多，频率高，培养方案统 一，传代培养容易，能大量获得的人经血间充质干细胞的制剂。
[0006] 为实现发明目的，本发明所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，是由人经血间 充质干细胞与趋化因子CXCL8和生理盐水配制而成。
[0007] 优选的，所述的用于治疗肝纤维化的干细胞制剂，其人经血间充质干细胞的浓度 为（1~3) X 106/ml，趋化因子CXCL8的浓度为（0. 1~0. 2)ng/ml，所述生理盐水为150~ 250ml〇
[0008] 优选的，所述的趋化因子CXCL8的体积含量为0. 1 %。
[0009] 优选的，所述人经血间充质干细胞为贴壁生长的成纤维样细胞，该细胞表达⑶29， CD44, CD73 和 CD 90,不表达 CD34, CD45, CD117 和 HLA-DR。
[0010] 本发明的另一目的还在于一种用于治疗肝纤维化的干细胞制剂的制备方法，包括 如下步骤：
[0011] (1)单核细胞分离：将收集到的经血样品进行常规微生物和传染病病原体安全检 测，采用1. 0779/ml的Ficoll进行密度梯度离心，分离合格样品的单核细胞；
[0012] ⑵间充质干细胞分离培养：用PBS将分离到的单核细胞洗涤3次，调节细胞密度 至（3~5) X106个细胞/ml，接种于培养瓶中置37°C、5% C02培养箱中培养，用细胞培养 液孵育细胞；细胞培养48小时后，胰蛋白酶-EDTA消化，PBS洗涤细胞，间充质干细胞重新 接种于新的培养瓶，每周传代2次，直至细胞达到所需要细胞浓度，即终止传代培养。
[0013] (3)经血间充质干细胞制剂配制：将收集的经血干细胞用150~250ml的生理盐 水调节细胞数目为（1~3) X 106/ml并加入浓度为（0. 1~0. 2)ng/ml体积含量为0. 1的 趋化因子CXCL8配制成经血干细胞注射液。
[0014] 优选的，所述的步骤2)中用到的细胞培养液包括DMEM培养基，双抗培养基，两性 霉素B，谷氨酰胺和胎牛血清混合物。
[0015] 优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养基，体积含量为1 %的双抗培养基，体积含 量为1 %两性霉素B，体积含量为1 %谷氨酰胺和体积含量为20%胎牛血清的混合物。
[0016] 本发明关于用于治疗肝纤维化的干细胞制剂采用人经血间充质干细胞与趋化因 子CXCL8和生理盐水配制而成的源自：经血间充质干细胞（menstrual blood mesenchyme stem cells，MBMSC)是源自健康女性经血中的间充质干细胞，这种细胞扩增能力强，分泌细 胞因子种类多；具有多向分化潜能，可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、心肌细胞、成骨细胞、 神经细胞等多种细胞；免疫原性低，无侵入性；获取方法简单、安全，不受伦理限制。MBMSC 由于其具有以上这些优点，已经应用于帕金森综合征、脑中风、糖尿病、肝硬化等疾病的治 疗研宄中，并取得了良好的治疗效果。已有研宄表明，MSC体内移植后能够分化为肝实质细 胞，抑制星状细胞形成，因此经血MSC具有治疗肝纤维化的潜能。MSC体内移植一般采取静 脉输注的方式，因此提高经血MSC在体内的活性及定向迀移能力是临床应用的关键。
[0017] 研宄表明趋化因子CXCL8对中性粒细胞有趋化作用，参与组织炎症反应。肝纤维 化中CXCL8的表达显著升高，在肝硬化阶段仍维持高水平状态。CXCL8既可以直接的趋化骨 髓来源的MSC，又可以增强基质细胞衍生因子1对BMMSC的趋化作用。因此本发明利用趋 化因子CXCL8制备经血干细胞注射液，促进MBMSC向纤维化肝组织聚集，提高损伤修复的能 力。
[0018] 本发明的有益效果主要体现在：经血间充质干细胞获取方法简单，不受伦理限制， 且其细胞活力高，增殖力强，具有多向分化潜能，制备简便；将人经血间充质干细胞移植到 肝纤维化模型的小鼠和患者体内，能显著调理受损肝脏组织的微环境，改善肝功能状态，促 进肝脏病理恢复；本发明的经血间充质干细胞制剂输注技术操作简单方便，利用经血间充 质干细胞治疗肝纤维化，开发用于治疗组织损伤的的干细胞制剂街制备方法具有非常重要 的临床意义和广阔的应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1为肝脏组织病理切片检查结果（HE染色，放大200倍）；