高密度脂蛋白模拟肽在动员内皮祖细胞修复内皮损伤的药物中的应用
【专利说明】高密度脂蛋白模拟肽在动员内皮祖细胞修复内皮损伤的药物中的应用
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及高密度脂蛋白模拟肽ReVerSe-D-4F的应用领域，具体为高密度脂蛋白模拟肽在动员内皮祖细胞的药物中的应用。
【背景技术】
[0003]动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是危害人类健康最严重的心脑血管疾病之一，故阻止AS的进展已成为基础医学与临床医学研究的热点。一些危险因素(如高脂食物、吸烟和高血压等)诱导的内皮损伤是AS的始动因素，因此维持内皮完整是防治AS的重要策略之一。起初认为受损的内皮细胞由临近完整内皮组织修复，但这些内皮细胞增殖分裂50代之后即会老化，导致成熟内皮细胞修复受损内皮的能力有限，最近研究证明，体内血液循环中存在一些内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPC),它们起源于骨髓单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),并参与血管内膜修复和AS斑块的发生发展。但心血管病人外周血中内皮祖细胞数量减少，且功能(如增殖、迁移和成血管)也受到一定损伤，因此怎样动员外周血内皮祖细胞数量和提高内皮祖细胞功能去修复受损内皮是减轻AS发生发展的一个新的治疗思路。
【发明内容】
[0004]本发明针对以上不足之处，提供了一种高密度脂蛋白模拟肽在动员内皮祖细胞修复内皮损伤的药物中的应用，为上调血浆中SDF-1 α水平提供了新的技术手段，也为ReVerse-D-4F保护心血管系统提供了新的思路和策略。
[0005]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:高密度脂蛋白模拟肽在动员内皮祖细胞修复内皮损伤的药物中的应用。
[0006]所述高密度脂蛋白模拟肽是指ReVerSe-D-4F。
[0007]高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)具有明显的抗AS功能,重组HDL制品和HDL蛋白结构与功能模拟肽的报道为AS的防治打开了又一扇明亮的窗户。美国伯明汉Anantharamaiah课题组通过对HDL的主要蛋白成分载脂蛋白A I (ΑΡ0Α I)的抗AS结构特征和生物学特性研究发现，APOAI的A型两亲性螺旋结构具有较强的脂质结合能力，其模拟肽是人工合成的具有APOAI类似功能的两亲性螺旋肽类。申请人先前在美国加州大学的课题组和Navab课题组的研究分别证明由人工合成的该模拟肽的18个氨基酸肽链RD4F和D4F均能够抑制血脂紊乱所导致的小鼠AS。2006年Tso等实验证明重组HDL可以增强内皮祖细胞介导的内皮修复。随后Oostoom等报道重组HDL可以增加II型糖尿病人循环血液中内皮祖细胞的数量。申请人新近的研究表明，模拟肽通过增强人主动脉内皮细胞NO分泌，抑制脂多糖和肿瘤坏死因子诱导的人主动脉内皮细胞的炎症细胞趋化作用，从而发挥可能的内皮细胞保护功能，而在内皮修复再生中起重要作用的EPC是否也与模拟肽的内皮保护作用有关迄今尚无答案。结合申请人课题组前期的实验结果，即应用动物模型证实HDL的主要蛋白成分APOAI模拟肽具有抗AS作用，并依据内皮系统损伤修复可能涉及新近提出的血管壁祖细胞理论，申请人等假设APOAI模拟肽的抗AS作用可能通过动员EPC和增强EPC的损伤修复能力并完成对动脉血管壁受损内皮的修复，从而保护内皮系统结构与功能的完整性，最终减少AS的发生。本研究把C57 BL/6小鼠分为四组，分别为正常饮食、正常饮食和模拟肽、高脂饮食、高脂饮食和模拟肽，首先流式分析外周血EPC数量，免疫荧光检测动脉壁EPC数量，ELISA检测外周血细胞因子和炎症因子，其次体外培养内皮祖细胞探讨APOAI模拟肽对肿瘤坏死因子a (TNF- α )诱导的EPC损伤修复的作用机制。
[0008]本发明首先将6周龄C57 BL/6小鼠分为四组喂养16周，分别为正常饮食、正常饮食和 Reverse-D_4F (lmg/Kg/d)、高脂饮食、高脂饮食和 Reverse_D_4F (lmg/Kg/d),流式分析外周血EPC数量，免疫荧光检测动脉壁EPC数量，ELISA检测外周血细胞因子和炎症因子，其次体外培养内皮祖细胞探讨APOAI模拟肽对TNF- α诱导的EPC损伤修复的作用机制。
[0009]本发明发现高密度脂蛋白APOAI模拟肽ReVerSe-D-4F能明显降低高脂饮食小鼠外周血TNF-α、一氧化氮(NO)和血管内皮生长因子(VEGF)的升高，但对高脂饮食小鼠总胆固醇的含量并没有显著作用，同时发现无论在高脂饮食小鼠还是在正常饮食小鼠血浆中，Reverse-D-4F均能明显提高SDF-1 α的含量；免疫荧光研究发现ReverseHF能明显提高高脂饮食小鼠外周血和动脉壁EPC的数量，相关性分析发现外周血EPC的数量和血浆中基质细胞衍生因子a (SDF-1a)的含量呈显著正相关，而与血浆中TNF-α的含量呈显著负相关。全血进行血细胞计数仪分析发现Reverse-D-4F降低高脂饮食小鼠外周血白细胞、单核细胞和中性粒细胞的数量，增加外周血淋巴细胞的数量。用TNF-a和Reverse-D-4F处理体外培养EPC来研究Reverse-D-4F对EPC的保护作用，实验发现TNF- a (30ng/ml)明显损伤内皮祖细胞增殖、迁移和体外成血管的功能，ReverSe-D-4F对TNF- α诱导的EPC损伤具有一定修复的作用，进一步实验发现该修复机制是通过PI3K/AKT信号通路。本研究表明:ReVerSe-D-4F是通过提高高脂饮食小鼠血浆SDF-1 α和降低高脂饮食小鼠血浆TNF-a实现对EPC动员的作用；Reverse-D_4F通过PI3K/AKT信号通路修复TNF-α诱导的EPC损伤。上述发现为ReVerse-D-4F保护内皮系统提供了新的分子机制和研究思路，为ReVerSe-D-4F治疗新血管疾病提供了可能的新策略。
[0010]本发明的优点在于:
1、本发明开发了 ReverSe-D-4F的新用途，即动员高脂饮食小鼠EPC，降低高脂饮食小鼠白细胞、单核细胞和中性粒细胞数量，提高淋巴细胞数量。
[0011]3、本发明为上调血浆中SDF-1 α水平提供了新的技术手段。
[0012]4、本发明为ReVerSe-D-4F的心血管保护作用提供了新的分子机制。本发明发现ReVerSe-D-4F可激活PI3K/AKT信号通路修复TNF- α诱导的EPC损伤，该通路被证实参与多种心血管保护作用。
【附图说明】
[0013]图1.各组C57 BL/6小鼠血浆总胆固醇、TNF-a、NO、