带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学和生物医学工程领域，具体涉及一种带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物及其制备方法。
【背景技术】
[0002]现实社会中交通事故、工伤事故、运动意外、地震、战争及临床手术等事件均会造成周围神经损伤，临床上但当中长距离的神经缺损不能依靠端对端的缝合来弥补神经缺失时，就不得不依靠移植物来桥接修复。目前临床上自体神经移植仍然是治疗这类疾病最好的方法。因为供移植用的自体神经来源有限、产生新的创伤、组织结构和尺寸难以相匹配和移植供区长期失神经支配等原因，导致自体神经移植应用的很大局限性。近年来，基于生命科学与工程学的原理和技术发展起来的组织工程学为构建神经移植替代品提供了一条新的出路。采用组织工程技术修复神经损伤的研宄主要集中在设计和构建新的组织工程神经桥接装置，目前这类桥接物通常是单独采用生物材料，通过将其加工成管状结构的神经引导通道，为神经的再生提供适当的空间和引导作用。传统人工神经移植物多采用注模方法制备，或采用静电纺技术与生物打印技术相结合的方法生产纳米纤维的人工移植材料。中国专利公开号CN101829361A公开了一种用于组织修复的纳米仿生材料及其制备方法，所述纳米仿生材料包括纳米仿生支架和附着于其上的水溶胶，水溶胶内包覆有一种或几种营养因子和/或细胞。其所述制备方法包括制备电纺溶液和含有营养因子和/或细胞的水溶胶溶液；用静电纺丝制得纳米仿生支架；用喷墨打印机将含有营养因子和/或细胞的水溶胶溶液打印到纳米仿生支架上等步骤。申请号为CN200410027221.4的中国专利文献公开了一种组织工程化周围神经移植物，使用生物降解材料制备的由微丝组成的束状微丝结构作为支架，其外表面包覆一层膜，形成管状支架。现有技术下在导管内植入纤维支架，目的在于引导施万细胞迀移，有利于神经选择性生长，减少运动和感觉神经错向生长(如图1所示)。然而神经的移植再生并不是简单的“修补”，而是需要靠“桥梁”引导近端神经纤维定向长向靶器官。由于神经纤维数目多，桥接难度大(图2为神经解剖结构示意图)，神经的移植再生仍然是众多科学院需要攻克的难题。现有技术下的神经移植物，导管内单纯内置微丝很难均匀的分布于导管内部，作为“桥梁”的微丝很容易相互聚集在一起，因此在实际应用中，定向导向的作用很有限，影响治疗效果。
[0003]喷墨打印技术是将墨滴喷射到接受体形成图像或文字的非接触性打印技术，它不仅应用于办公喷墨打印机，而且被成功的运用于医学与生物医学工程中，形成了生物打印技术。生物打印能按预定计划精确定位，生物打印的纸片理论上设计为一种在体内可降解的生物纸片；生物打印的墨水理论上设计为特质的细胞溶液或有生物活性的营养因子溶液。将这种特制溶液喷射到可生物降解的生物纸片上。打印后再将纸片按一定顺序堆叠。使用生物打印技术，可以将细胞或/和营养因子精确的结合到预定部位。
[0004]随着该技术的研宄不断深入，研宄表明喷墨打印技术适用于打印细胞、生物支架材料和细胞活性因子，其在器官打印中的应用也日益受到关注，这为组织工程在构建纤维组织和器官中的成功运用带来了新的希望。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于生物打印技术的带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物及其制备方法，所述组织工程神经移植物是由可降解聚合物材料通过生物打印制得，包括导管、管内纤维支架和悬丝。所述制备方法是:精确模拟不同神经的三维空间结构，利用生物打印技术，通过调整喷墨打印机的喷嘴的大小、数量、喷嘴到底层的距离、增压器脉冲频率和编制特定打印的控制程序，用喷墨打印机将聚合物材料溶液三维打印成的神经移植物。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种纤维支架表面和/或导管内外表面还包覆有营养因子和/或细胞的带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物及其制备方法，将上述通过生物打印技术制备得到的神经移植物浸泡在含有细胞和/或营养因子的培养液中，使神经移植物支架内部或者表面和导管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子，或者，利用生物打印技术，通过设计相应的控制软件和调整喷墨打印机的喷嘴的大小、数量、喷嘴到粉末层的距离、喷头移动速度和层间隔的时间，用喷墨打印机将聚合物材料溶液和细胞和/或营养因子的水溶胶溶液三维打印成型。
[0007]本发明的具体技术方案如下:
一种带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物，包括导管和管内纤维支架，其特征在于每根纤维支架的沿纤维长度方向上设有若干根悬丝与导管内壁相连，纤维支架通过悬丝分布悬挂于导管内，优选均匀分布悬挂于导管内。
[0008]上述组织工程神经移植物的一个优选方案，每根纤维支架的悬丝呈周向分布，且不同的纤维支架的悬丝位置和/或周向角度不同，保证悬丝和其它纤维支架以及其它悬丝之间没有接触，而且均匀分布在导管内，从而充分引导周围神经再生。进一步的，上述组织工程神经移植物的导管壁上还分布有多个微孔，为神经再生提供空间，管壁有利于物质交换和血管再生。优选微孔孔径为10-100 μ m，孔隙率50% -90%。
[0009]上述组织工程神经移植物的一个优选方案，所述导管直径l_9mm，导管壁厚为0.5-2mm，所述管内纤维支架的直径为0.05-0.3mm，支架的根数为3_30根，所述悬丝直径为0.05-0.3mm。
[0010]优选的，悬丝的数量为2-5根。
[0011]上述的神经移植物支架表面和/或导管内外表面还可以包覆有营养因子和/或细胞，所述细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、皮肤干细胞中的一种或几种组合，包覆在所述导管和管内纤维支架表面的细胞密度为I X 16-1 X 108/ml ;所述营养因子为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3 (NT-3)、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF)中的一种或几种，营养因子在神经移植物支架材料上的量为I yg/g-10mg/g。
[0012]上述的神经移植物导管和管内纤维支架为可降解聚合物材料，优选聚乳酸、聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物。
[0013]本发明还提供了一种上述带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物的制备方法，包括以下步骤: (1)制备含有神经移植物材料的溶液置于打印机墨盒中；
(2)调整打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为4-16个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；
(3)通过精确模拟不同神经的形状及三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，利用生物打印技术，按照神经的实际形态需求进行高真度仿真打印，使用步骤(2)参数进行打印，形成导管、悬丝和管内均匀分布纤维支架的组织工程神经移植物。
[0014]本发明还提供了一种上述带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备含有神经移植物材料的溶液、细胞和/或营养因子溶液，分别置于独立的墨盒中；
(2)调整与装有神经移植物材料墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为2-10个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ;调整与装有细胞和/或营养因子的墨盒连接的打印机喷嘴针头直径为50-200 μ m，针头数量为2-6个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；
(3)精确模拟不同神经的形状和三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及设计细胞和/或营养因子包覆形态，编制一定的打印程序，打印机预设三维模型，使用步骤(2)参数进行打印，形成导管、悬丝和管内均匀分布的纤维支架，支架内部或者表面和导管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子。
[0015]本发明还提供了一种上述带有悬丝纤维支架的组织工程神经移植物的制备方法，包括以下步骤:
(1)制备含有神经移植物材料的溶液置于墨盒中；
(2)调整打印机喷嘴针头直径为2-200μ m，针头数量为4-16个，喷嘴到底层的距离为10-50mm，增压器脉冲频率l_50v ；
(3)精确模拟不同神经的形状和三维空间结构，设计组织工程神经移植物的形状，以及细胞和/或营养因子包覆形态，编制一定的打印程序，打印机预设三维模型，使用步骤(2)参数进行打印，形成导管、悬丝和管内均匀分布的纤维支架。
[0016](4)将步骤(3)制备得到的神经移植物浸泡在含有细胞和/或营养因子的培养液中，使神经移植物支架内部或者表面和导管内外表面包覆有一种或几种细胞和/或营养因子。
[0017]上述的制备方法中神经移植物材料为可降解聚合物材料，优选聚乳酸、聚乙醇酸、胶原、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、丝素蛋白、角蛋白中的一种或者其中几种混合物；可降解聚合物材料溶液溶剂选自醋酸，草酸，苯甲酸，柠檬酸中的一种或几种任意比例的水溶液。
[0018]上述的制备方法中的细胞包括来源于自体或异体，为雪旺细胞、成纤维细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞、皮肤干细胞中的一种或几种组合。
[0019]上述的制备方法中营养因子为碱性成纤维生长因子(bFGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3 (NT-3)、胶质细胞源神经营养因子(⑶NF)中的一种或几种。
[0020]上述的组织工程神经移植物用于周围神经缺损和脊髓损伤。
[0021]所述喷墨打印机优选改装的惠普打印机55C喷墨打印机，改装方法参考美国专利US7051654，采用墨盒型号为HP51626A 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
(1)本发明利用生物打印技术，利用悬丝的支撑力将组织工程神经移植物的内置微丝稳定均匀分布在导管中，打破了以往的加工技术如模具加工、静电纺丝难以实现的技术瓶颈。本发明所述组织工程神经移植物，作为神经细胞生长“桥梁”的纤维支架被悬丝悬于导管内，每根纤维支架具有独立的空间，保证神经细胞能够沿着纤维支架定向生长而不会发生错误的桥接，极大的提高了手术的成功率；
(2)本发明利用生物打印技术，可根据患者缺损神经的结构和大小，设计模型尺寸和结构，精确打印得到组织工程神经移植物用于周围神经缺损和脊髓损伤的治疗；
(3)本发明的神经移植物所用可降解的聚合物材料为对人体无毒无害，不会带来免疫排斥、病毒传播、疾病传染的诸多风险；
(4)本发明的神经移植物根据神经修复过程自动安全降解，降解产物被人体完全吸收，避免了免疫组织反应；
(5)本发明使用的生物打印技术简单易行，成本较低，生产过程安全可控；
(6)本发明采用种子细胞相对于现有技术中采用的神经干细胞和神经胶质细胞而言，骨髓间充质干细胞具有自我更新、高度增殖等干细胞特点，并具有分化为雪旺氏细胞的潜能，骨髓间充质干细胞和雪旺氏细胞来源丰富，取材方便，容易分离纯化，而且为同种同体细胞来源，无免疫排斥反应，更适于作为良好的种子细胞，用于构建组织工程化神经，特别是用于对粗大神经干长距离的缺损和陈旧性周围神经缺损的修复