br>[0031] 药物 绿原酸，由四川九章生物科技有限公司所制备，含量99.2%。批号：131101。实验时用 生理盐水配制成高、中、低三个浓度的溶液备用。强的松，浙江仙琚制药股份有限公司生产， 5mg/片，批号：110502 ;大肠杆菌脂多糖，sigma公司生产，L〇t58kp8725,使用前用生理盐水 分别配制成0. 25g/L备用。HEP-2细胞片Scimedx公司生产。荧光素标记的山羊抗小鼠血 清（FITCGoat Anti-Mouse IgG)，Vector公司。ENA多肽免疫印迹膜条，深圳恒佳公司生 产。生物素结合山羊抗小鼠血清（biotin goat anti-mouse IgG) ,Vector公司。辣根过氧 化物酶-卵白素结合物（HRP-avidin)，Vector公司。
[0032] 仪器 紫外灯：上海特种灯具厂生产，30W，最大能量光谱为312nm，能量为2.OMj/cm2,距离为 30cm，中波紫外线（UVB)部分占其辐射能量的60%以上；奥林巴斯BH-2万能显微镜，日本 OLYMPUS公司生产；菲利普M800透射电镜，荷兰PHILIPS公司生产。
[0033] 方法 小鼠背部剃毛，紫外线急性照射2h/d*3d，距离30cm，照射后一次性ipLPS2. 5mg/kg， 24h造模成功；正常对照组小鼠ip生理盐水。模型小鼠ipLPS24h后开始灌胃给药。绿 原酸实验组分别以高、中、低剂量组给药，剂量分别为l〇mg/kg*d、20mg/kg*d、40mg/kg*d灌 胃。阳性对照药A组青蒿琥醋（Artesunate) 2mg/kg*d灌胃，13组强的松（Prednisone)Img/ kg*d灌胃。模型和正常对照组小鼠均0.4ml/只生理盐水灌胃。连续给药15d，各组动物分 别于14d、21d、28d时去眼球采血，37°C水浴Ih后离心，2000r/min，5min，抽取血清备用。21d 时采过血的动物脱白致死，立即取肝脏和肾脏，分别入电镜固定液和光镜固定液。
[0034] 血清学检测 将小鼠血清用深圳恒佳专用缓冲液以1 :1〇〇稀释，然后将稀释好的血清200uL分 别加入相应编号的反应槽中，37 °C温箱孵育30min，缓冲液洗涤4次，每次2min;加入 200uLl: 100 稀释的biotingoatanti-mouseIgG，37°C温箱孵育 30min，缓冲液洗绦 4 次， 每次2min;再加入1:100稀释的HRP-avidin200uL，37°C温箱孵育30min，洗绦同上。加入 反应液A和B至阳性条带出现，缓冲液洗涤。与同一试剂盒内的ENA多肽抗体谱标准带比 对，如阳性条带出现于28/29, 13. 5ku多肽；15, 16. 5,38ku多肽；52ku多肽及47/48,45ku多 肽上，可判定为抗Sm，抗Rib，抗ssA和抗ssB抗体阳性。将血清用PBS缓冲液以1:40稀释， 然后将稀释好的血清20-30uL分别滴入HEp-2细胞片小窝中，每组一张细胞片。在滴加血清 的过程中应注意不能触及细胞片的表明。将加好血清的细胞片置于湿盒中，室温（25°C)下 放置30min。30min后将细胞片取出，用PBS小心洗出血清，然后用PBS小心洗涤2次，每次 5min;洗好后用Scimedx公司专用的吸水纸吸去多余的PBS(这一过程应注意避免细胞底物 变干而影响结果）。滴入稀释好的（PBSl: 100稀释）FITCgoatanti-mouseIgG20_30uL， 湿盒内室温下30min。PBS洗涤，步骤同上。吸水纸吸去多余PBS，加1-2滴荧光封片剂于细 胞片上，盖玻片封片，OlympusBH-2万能显微镜观察，照相。
[0035] 三重染色标本的制备 21d时用于三重染色，光镜观察的标本用10%福尔马林固定，然后脱水、透明、浸蜡和 包埋，进行切片。切片厚3um，染色开始时经常规脱蜡至水，0. 5 %高碘酸氧化后，浸入六胺银 工作液中约2h(恒温58°C)，蒸馏水洗，苏木素染lmin，水洗后丽春红染液滴染5min，70% 乙醇分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[0036] 电镜标本的制备 21d时电镜观察的标本用2%多聚甲醛+0.25%戊二醛混合固定液固定4h，TBS缓冲 液漂洗，1%锇酸后固定lh，缓冲液漂洗，丙酮脱水，醋酸铀染色2h，Epon812浸透并包埋， LEICA超薄切片机切片，铅液染色，缓冲液冲洗，标本变干后即可进行透射电镜观察。
[0037] 结果 2. 1动物死亡情况 60只动物ipLPS24h时共有6只动物死亡，雌雄各3只，此后至给药第28d各给药组 及各对照组无动物死亡。
[0038] 血清学检测结果 治疗14d、21d、28d时所采动物血清ENA多肽抗体检测及ANA检测结果见表1、2、3,图 1-5 ;各组结果均无性别差异。
[0039] 表I14d时ENA多肽抗体和ANA检测结果
【主权项】
1. 一种绿原酸在制备治疗红斑狼疮的药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其中所述药物为改善免疫机能。
3. -种用于治疗红斑狼疮的制剂，所述制剂包含绿原酸和药物上可接受的赋形剂或辅 料。
4. 如权利要求3所述的制剂，所述的制剂为口服制剂、注射制剂或外用透皮给药制剂。
5. 如权利要求3或4所述的制剂，所述制剂的每制剂单位含绿原酸Ι-lOOOmg，临床使 用剂量为l-l〇〇mg/kg。
6. -种用于治疗红斑狼疮的联合用药物，所述联合用药物包括绿原酸和治疗红斑狼疮 的药物。
7. 如权利要求6所述的联合用药物，所述治疗红斑狼疮的药物选自羟基氯喹、甲氨喋 呤、硫唑嘌呤、氯苯酚嗪、胸腺素、左旋咪唑、强的松中的一种或几种。
【专利摘要】本发明公开了一种绿原酸在制备治疗红斑狼疮的药物中的应用。所述应用通过绿原酸改善免疫机能从而达到治疗红斑狼疮的目的。本发明还公开了一种用于治疗红斑狼疮的制剂，所述制剂包含绿原酸和药物上可接受的赋形剂或辅料。本发明还公开了一种用于治疗红斑狼疮的联合用药物，所述联合用药物包括绿原酸和治疗红斑狼疮的药物。
【IPC分类】A61P37-02, A61K31-216
【公开号】CN104644623
【申请号】CN201510078874
【发明人】张洁, 贾静, 黄望
【申请人】四川九章生物科技有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年2月13日