一种人工角膜的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于技术领域，具体涉及一种人工角膜的制备方法。
【背景技术】
[0002]角膜位于眼球最前端，是光线穿过的第一个屈光间质，其透明度是保证良好的视功能的第一要素。因此，人工角膜不同于其他组织工程产品，通过不同方法制备后，不仅需要保持其细胞外支架良好的力学性能，同时对于支架材料的透明度要求也很高。
[0003]目前已有多种人工角膜的制备方法，但是在实际应用中效果不佳。
[0004]人工角膜最早于I960年代开始在临床实验中出现，最初使用玻璃材质将其直接缝于眼表面。虽然这种治疗方法可以提高患者的视力，但是由于短时间发生排斥反应，人工角膜周围组织溶解，人工角膜脱落，使得手术失败。随着材料科学的不断进步，人工角膜不断发展，目前在临床上使用的人工角膜主要是BostenKPro、AlphaCor和Osteo?Odonto获得FDA批注进入临床阶段。
[0005]Bosten I型角膜最早应用于临床的人工角膜，有PMC制备，具有较好的组织相容性和透明度。Bosten II型在I型的基础上进行改进，优化了人工角膜的设计，使得移植手术更简单，缝合口渗漏几率下降；增加了钛合金固定装置，减少了因排斥反应而导致的人工角膜脱出。
[0006]Osteo ?Odonto ?keratoprosthesis (OOKP)由意大利科学家 Strampelli 首创，利用自体组织(牙齿)作为周边支架，PMMA作为光学柱镜，这种骨齿型特殊结构对于增加角膜耐受性，更好的于宿主结合，起到积极作用。有报道称称，OOKP在患者体内最长已将近20年。虽然创造性引入自体组织作为角膜的一部分，减少了排斥率，植入后视力恢复也较好，但并发症仍不能避免，且手术难度大，费用高，限制其广泛应用。
[0007]AlphaCor型人工角膜，20世纪90年代澳大利亚L1n眼科研宄所的Chirila等将PHEMA水凝胶制作了一体式人工角膜AlphaCor，并在1998年进行首次人体试验。AlphaCor具有海绵状结构的支架和光学柱镜，由两部分含水量不同的PHEMA水凝胶组成，互穿网络结构连接，能够承受较高的压力和拉力。由于柱镜和周边支架都采用同一种材料，物理和化学性质相似，解决了两部分结合问题，同时也减少的结合部位发生感染的风险。Bleckman等将该种人工角膜植入4例患者，6个月后I例患者球结膜裂开，其余患者未出现任何并发症。这种角膜的主要并发症有角膜表层基质融化、镜柱出现沉积物以及角膜后膜等，虽然角膜的排斥率在逐渐降低，但是移植术后I年排斥率仍在20%左右。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种人工角膜的制备方法。
[0009]本发明的具体技术方案如下:
[0010]一种人工角膜的制备方法，包括如下步骤:
[0011](I)选料:收集适龄猪眼球；
[0012](2)预处理:刮除上述猪眼球的角膜上皮细胞和角膜内皮细胞，保留完整的角膜前弹力层，钻取指定大小角膜片；
[0013](3)冻融:在常温常压下，将步骤(2)获得的角膜片置于液氮8?35分钟，取出后在常温常压下将角膜片缓慢复温至室温，重复4?12次；
[0014](4)超声:将步骤(3)冻融处理后的角膜片置于生理盐水中进行常温常压下的超声波清洗，超声工作频率20?250kHz，超声时间15?65分钟；
[0015](5)酶降解:在常温常压下，将超声处理后的角磨片置于缓冲液中用核酸内切酶酶解角膜基质细胞DNA，即得所述人工角膜，该缓冲液的以培养液为溶剂，还包括0.1?0.5%的非必需氨基酸、2?3%的酸碱调节剂和10?60mol/L的无机阳离子和10?60mol/L的无机阴离子，pH值为7.0?7.5，渗透压为330?390m0sm/L，核酸内切酶的浓度为5?55 μ g/mL，酶解时间20?230分钟。
[0016]在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(I)为:收集4?12月龄猪眼球。
[0017]在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为:在常温常压下，将步骤(2)获得的角膜片置于液氮10?30分钟，取出后在常温常压下将角膜片缓慢复温至室温，重复5?10次。
[0018]在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)为:将步骤(3)冻融处理后的角膜片置于生理盐水中进行常温常压下的超声波清洗，超声工作频率20?200kHz，超声时间20?60分钟ο
[0019]在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(5)为:该缓冲液的以培养液为溶剂，还包括0.1?0.5%的非必需氨基酸、2?3%的酸碱调节剂、10?50mol/L的无机阳离子和10?50mol/L的无机阴离子，pH值为7.2?7.4，渗透压为350?380m0sm/L，核酸内切酶的浓度为5?50 μ g/mL,酶解时间20?200分钟。
[0020]在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸内切酶为限制性核酸酶I，限制性核酸酶II或混合型核酸内切酶。
[0021]在本发明的一个优选实施方案中，所述培养液为SFM，MEM, DMEM，BME或HAMF12。
[0022]在本发明的一个优选实施方案中，所述酸碱调节剂为碳酸钠一碳酸氢钠缓冲对、磷酸氢钠一磷酸二氢钠缓冲对、HEPES或硼酸一硼砂缓冲对。
[0023]在本发明的一个优选实施方案中，所述无机阳离子为钠离子、锂离子、铝离子、钙离子和镁离子中的至少一种，所述无机阴离子为氯离子、氢氧根离子、碳酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子和硫酸根离子的至少一种。
[0024]在本发明的一个优选实施方案中，所述非必需氨基酸为甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸、精氨酸和组氨酸中的至少一种。
[0025]本发明的有益效果是:
[0026]1、本发明的制备方法去除猪角膜的中活细胞的同时最大程度地保持了天然角膜胶原纤维的排列，保证了角膜的透明。
[0027]2、本发明的制备方法制备的人工角膜的天然胶原纤维之间的空隙有利于诱导受体角膜细胞的生长和神经纤维的生长，促进供体角膜修复和重建。
【附图说明】
[0028]图1为本发明实施例1制备的角膜片与未经处理的角膜片的对比结果图；
[0029]图2为本发明实施例1制备的人工角膜的HE染色图；
[0030]图3为本发明实施例1制备的人工角膜向新西兰大白兔进行板层角膜移植术后3月的结果图；
[0031]图4为本发明实施例1中经核酸内切酶处理后的人工角膜的DNA电泳结果图。
【具体实施方式】
[0032]以下通过【具体实施方式】结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0033]实施例1
[0034](I)选料:收集4?12月龄猪眼球；
[0035](2)预处理:刮除上述猪眼球的角膜上皮