[0090] 按多糖：蛋白=1:0. 8~1.2 (w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍 生物溶液中，按多糖：碳二亚胺=I: l〇(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5±3°C、 pH5. 7±0. 2,反应60分钟，然后调节pH至6. 9±0. 1终止反应，经澄清过滤后，用0. 15mol/ L氯化钠溶液为超滤液，用超滤膜包超滤去除碳二亚胺，然后将多糖蛋白结合物溶液用 S印harose 4FF凝胶层析柱纯化，以0· 15mol/L NaCl溶液为流动相，监测0D280nm的吸收 值，收集VO附近的洗脱峰，合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤 后，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液。
[0091] 2.疫苗配制：将A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b 型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照I: I: I (w/w)合并混匀，加入乳糖，用注射用水稀释，即 为AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品。
[0092] S4.制备冻干制剂：将A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原 液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照I: I: I (w/w)合并混匀，加入乳糖，用注射用水稀 释，即为AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品；
[0093] S5.分装和包装
[0094] 将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射 器中，每瓶0. 5ml，AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品按照0. 5ml/瓶分装 于西林瓶中进行真空冷冻干燥后再独立包装。
[0095] 实施例6 :成品检定
[0096] 1鉴别试验
[0097] 采用酶联免疫法检测PT、FHA、PRN抗原，应含有相应抗原（《中国药典》2010版三 部"吸附百白破联合疫苗"中附录IXS)。采用絮状试验（《中国药典》2010版三部"吸附百 白破联合疫苗"中附录XIDS),本品应与白喉抗毒素、破伤风抗毒素出现絮状反应。采用免 疫双扩散法（《中国药典》2010年版三部附录VDI C)，本品应与A群脑膜炎球菌免疫血清、C 群脑膜炎球菌免疫血清、b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉 淀线。
[0098] 2物理检查
[0099] 2. 1外观：冻干制剂应为白色疏松体，按标示量加入吸附无细胞百白破后应迅速 复溶为白色混悬液，无摇不散的凝块或异物。
[0100] 2. 2装量：依法检查（《中国药典》2010版三部，附录IA),应不低于标示量。
[0101] 3化学检查
[0102] 3. IpH 值：应为 5. 8 ~7. 2
[0103] 3. 2氯化钠含量：应为L 5~9. 5g/L(《中国药典》2010版三部，附录VII G)。
[0104] 3. 3氢氧化铝含量：应为1.0~1.5mg/ml(《中国药典》2010版三部，附录VII F)。
[0105] 3. 4游离甲醛含量：应不高于0.2g/L(《中国药典》2010版三部，附录VI F)
[0106] 3.5戊二醛含量：应小于(λ 01g/L(《中国药典》2010版三部，附录VI D)。
[0107] 3. 6水分：应不高于3.0% (《中国药典》2010版三部，附录VII D)。
[0108] 3. 7多糖含量
[0109] 按标示量用纯化水复溶后，取IOml超滤去乳糖后，用容量瓶定容至10ml。
[0110] 取处理后的溶液，以D核糖为对照，按核糖含量计算供试品中Hib多糖含量，每1 次人用剂量应为10~15 μ g(《中国药典》2010年版三部附录VDI J)。
[0111] 取处理后的溶液，测定其中总磷含量（《中国药典》2010年版三部附录W A) JfHib 多糖含量按比例（Hib多糖含量：磷含量为11.40:1)计算出Hib多糖中磷含量，再将总磷 含量减去Hib多糖中磷含量，得到A群多糖磷含量，按比例（A群多糖含量：磷含量为1000 : 80)计算出A群多糖含量，每1次人用剂量应为10~15 μ g。
[0112] 取处理后的溶液，测定C群多糖N-乙酰神经氨酸含量（《中国药典》2010年版三 部附录VI 0,再根据比例（C群多糖含量：N-乙酰神经氨酸含量为1000 :800)计算出C群 多糖含量，每1次人用剂量应为10~15 μ g
[0113] 3. 8游离多糖含量
[0114] 按标示量用纯化水复溶后，采用超滤去除乳糖，再用冷酚法测定游离多糖，A群和 C群的游离多糖含量放行标准为不高于18%，有效期内不高于20%。Hib游离多糖含量应 不高于15%，有效期内不高于20%。
[0115] 3. 9多糖分子大小测定
[0116] 用纯化水复溶后，采用琼脂糖CL-4B凝胶柱（I. 6cmX 100cm)测定A群、C群多糖 和Hib多糖的分子大小。Kd值小于0. 20的洗脱液多糖回收率放行标准均应不低于65%， 有效期内标准均应不低于60% (《中国药典》2010年版三部附录VDI G)。
[0117] 4.效价测定
[0118] 4.1无细胞百日咳疫苗
[0119] 每1次人用剂量中的免疫效价应不低于4. OIU(按《中国药典》2010版三部"吸附 百白破联合疫苗"中附录2进行。
[0120] 4. 2白喉疫苗
[0121] 每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU(《中国药典》2010版三 部，附录XI C)
[0122] 4. 3破伤风疫苗
[0123] 每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU(《中国药典》2010版 三部，附录XI B)
[0124] 5.效力试验
[0125] 每批疫苗皮下注射体重12~HgNIH(或BLAB/c)小鼠10只，另取同批小鼠10只 作为对照，注射灭菌PBS溶液。于第1、14和28天皮下注射三次，每次注射剂量为含7. 5 μ g 多糖（A群、C群、Hib多糖分别为2. 5 μ g)的A群C群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌（结 合）联合疫苗，于第35~42天经眼眶后静脉采血，分离血清；以ELISA法测定抗A群和抗 C群脑膜炎球菌多糖IgG抗体，以灭菌PBS溶液对照组小鼠血清的A值求出Cutoff值，放行 标准为供试品组应有90%以上小鼠的血清抗Hib、抗A群和抗C群脑膜炎球菌多糖IgG抗 体水平高于CuttofT值，有效期内标准不低于80%。A群C群多糖抗体几何平均滴度（GMT) 为等剂量A群和C群脑膜炎球菌多糖对照组的8倍以上为合格。
[0126] 6.无菌检查：依法检查（《中国药典》2010版三部，附录XII A)，应符合规定。
[0127] 7.热原检查
[0128] 依法检查（《中国药典》2010年版三部附录ΧΠ D)，注射剂量按家兔体重每Ikg注 射3. Oyg多糖（分别含A群多糖l.Oyg，含C群多糖LOygjib多糖LOyg)应符合规 定。
[0129] 8特异性毒性检查
[0130] 8.1无细胞百日咳疫苗
[0131] 按《中国药典》2010版三部"吸附无细胞百白破联合疫苗"附录2. 5项进行。
[0132] 8. 2白喉、破伤风疫苗
[0133] 用体重250~350豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2. 5ml，分两侧注 射，每侧I. 25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5~10天变成硬结，可能30天不完全 吸收。在第10、第20、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤 风及晚期麻痹症者为合格。
[0134] 9.毒性逆转试验：供试品置37°C四周，按《中国药典》2010版三部"吸附无细胞百 白破联合疫苗"附录2. 6项进行。
[0135] 10.细菌内毒素检查：每1次人用剂量应不高于500EU(《中国药典》2010年版三 部附录XII E)。
[0136] 将实施例1-4制备的联合疫苗采用上述方法进行检测，实验结果如表1所示：
[0137] 表1 :实施例1-4制备的联合疫苗的检测结果
[0138]
【主权项】
1. 一种联合疫苗，其特征在于，它由A组分和B组分组成： 所述A组分为液体制剂，它由以下组分组成： 百日咳毒素：5~40iig;丝状血凝素：5~40iig;百日咳黏附素：2~IOiig;白喉类毒 素：10~25LF;破伤风类毒素：4~IOLF;氢氧化铝：1. 0~2.Omg/ml;氯化钠：7. 5~9. 5g/ L； 所述B组分为冻干制剂，它由以下组分组成： A群脑膜炎多糖结合物：10~30 ii g ;C群脑膜炎多糖结合物：10~30 ii g ;B型流感嗜 血杆菌多糖结合物：1〇~30 ii g ;乳糖：5~20mg。
2. 如权利要求1所述的一种联合疫苗的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
51. 制备各单价疫苗原液：包括白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液、无细胞百日咳疫 苗原液，所述无细胞百日咳疫苗原液包括百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳黏附素；
52. 制备液体制剂：将百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素原液、破伤 风类毒素原液加入用氯化钠稀释的氢氧化铝佐剂内，调pH至5. 8~7. 2，即为无细胞百白破 疫苗半成品；
53.制备各单价疫苗原液：包括A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫 苗原液、b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液；
54. 制备冻干制剂：将A群脑膜炎球菌结合疫苗原液、C群脑膜炎球菌结合疫苗原液、b 型流感嗜血杆菌结合疫苗原液按照1:1:1 (w/V)合并混匀，加入乳糖，用注射用水稀释，即 为AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品；
55.分装和包装 将上述制备的吸附无细胞百白破联合疫苗半成品分装于西林瓶或者预灌装注射器中，AC群脑膜炎球菌-b型流感嗜血杆菌联合疫苗半成品分装于西林瓶中进行真空冷冻干燥后 再独立包装。
3.如权利要求2所述的一种联合疫苗，其特征在于，A组分由以下步骤制备而成： SI.制备各单价疫苗原液
511. 白喉类毒素原液：开启白喉杆菌，先在产毒培养基种子管中传1~3代，再转至产 毒培养基制成生产用种子；采用培养罐液体培养，培养基采用改良林氏培养基，34~36°C 培养45~52h，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上 清；上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加生理盐水溶 解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35~37°C，脱毒30天，除菌过滤即为白喉类毒 素原液；
512. 破伤风类毒素原液：开启破伤风梭状芽孢杆菌，先在产毒培养基种子管中传1~ 3代，再转至产毒培养基制成生产用种子；采用培养罐液体培养，培养基采用双胨培养基， 34~36°C培养62~72小时；培养结束后加入甲醛杀菌，培养液经过滤去除菌体，