用于将生物活性物质引入脑的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及研发一种用于将合成的和天然的生物活性的且药用的物质基于所述 物质和自由基性质的膜活性产物和/或该产物的源与鼻腔的神经和血管结构的交互作用 从鼻腔直接供给到脑中的医药生物方法。
【背景技术】
[0002] 环境是多种生物活性分子的源，所述生物活性分子随着食物或者从空气环境进入 到生物体中。生物活性分子的其它重要的源是生物体的内部源，这样的内部的源如是血液 和间质液。为了到达器官结构或者组织，生物活性物质必须从外部的和内部的环境中穿过 生物膜，例如穿过脑的膜结构。
[0003] 生物体的外部和内部环境的大量生物活性分子是有用的并且对于器官和组织包 括脑的正常地起作用是必要的，生物活性分子尤其是包括大多数药物以及许多生物化合 物一一新陈代谢的产物，所述产物在生物体中在代谢过程中形成。
[0004] 同时，将通常已知的和新的药物、生物技术产品供给到脑中以及用于治疗中枢 神经系统（ZNS)、尤其是脑的一系列代谢物的治疗应用，是严重的问题。在过去十年的科 学和专利文献中描述了将一些中枢性地作用的药物从鼻腔中供给到脑中的方法。（Ming Ming ffen(2011)http://www. discoverymedicine. com/Ming-mingffen/2011/06/13/ οIfactor y-targeting-through-intranasal-delivery-of-biopharmaceutical-drug s-t〇-the-brain-current-development/ ；Costantino H. R. et al. (2007). Intranasal delivery-Physicochemical and therapeutic aspects. International Journal of Pharmaceutics 337:1-24)。
[0005] 在Ming Ming Wen和Costantino等的工作中，描述了用于将药用物质从鼻腔中供 给到脑中的已知的措施。尤其包括：应用粘膜附着性辅助剂，所述辅助剂增强穿过膜的渗 透，这些辅助剂如是脂质体、纳米颗粒，并且甚至包括应用血管收缩剂，这没有充分的科学 依据。
[0006] 多种所描述的方法虽然可使一些小分子透入到脑中，然而所述方法对于宽范围的 药用物质而言不是通用的方法。
[0007] 显而易见的已知的解决方案为用于治疗和免疫的将药用物质经鼻运输到外周血 液中并且到脑中的方法（根据专利EP 1 031 347 BI)。作者确认，迄今为止所使用的经鼻 运输的方法不能够确保便捷且可接受地将药物活性物质运输穿过鼻腔的膜的令人信服的 原理。
[0008] 作者发现所述问题的解决方案的一个重要的要素是存在细胞因子或者其源的制 药学配方。然而作者所使用的方法仅是用于将药物在鼻部供给到外周血液循环和/或脑中 的一种可行的途径和一种免疫接种的手段，并且仅能够用作为进一步改进药物的鼻部供给 以用于治疗脑部疾病的药理和技术平台。
[0009] 所描述的方法的主要不足之处在于药物的准备和应用的复杂性以及对于水溶性 的化合物的特定的限制。该方法的另一个不足之处在于药用组合物的复杂的准备。
[0010] 之前已经发现：自由基物质或者其副产物、过氧化氢（H2O2)或者·ΝΟ活性产物、例 如L-精氨酸能够在特定的条件下确保提高鼻腔的神经和血管的膜结构的可透过性并且有 助于在透过时生物活性物质进入脑中（专利号DE 102 48 601，欧洲专利号010692)。
[0011] 至今已经大量地讨论了用于解决技术问题的构想，因此也在文献（Goldstein N. , et al. 2012, Blood-Brain Barrier Unlocked. Biochemistry(Moscow), Vol. 77, No. 5, pp. 419-424)中讨论。在该文献中，为了确定生物活性物质多巴胺在与微摩尔的过氧化氢一 起同时在鼻部导入时引入到脑中的有效性，执行借助于氚标记的多巴胺（DA)的试验。通常 已知的是，为此多巴胺不能够在常见条件下渗入到脑中并且在那里触发明显的效果。
[0012] 为了证实多巴胺在脑结构中的具体的生物活性，执行借助于同位素产品[3H]-多 巴胺并且借助于抗精神病药氟哌啶醇的动物实验的研宄。在此通常已知的是，多巴胺不能 够在常见条件下渗入到脑中并且在那里触发明显的生理或者治疗效果。为了证实多巴胺在 脑结构中的具体的生理活性，执行借助于同位素产品[ 3H]-多巴胺并且借助于抗精神病药 氟哌啶醇的动物实验的研宄。
[0013] 在制备用氚标记的[3H]-多巴胺时，使用多巴胺盐酸制剂中的氢相对于氚的高温 固相催化的同位素置换反应。所产生的制剂[ 3H]_DA在色谱柱Kromasil C18(8X 150mm)中 在乙腈的水溶液的浓度梯度中在存在0. 1%的七氟丁酸的情况下被涤出。所述制剂的定量 分析通过HPLC在使用DA标准（<〈Sigma/Aldrich>>)的条件下执行。均勾标记的DA的具体 的放射性为20Ci/Mol。所述制剂的储备溶液包含体活度为0. 75mCi/ml的KT2M的[3H]-多 巴胺。
[0014] 在准备鼻部导入多巴胺溶液时，制备[3H]-DA_溶液（浓度为4Χ10- 2Μ，体活度为 O. 75mCi/ml)与稳定的过氧化氢的等渗溶液的混合物（〈〈Sigma/Aldrich>>)。鼻部导入的 溶液中的多巴胺和H 2O2的终浓度相应为KT2M和10_5M。在实验动物组中导入[ 3H]-DA-溶 液和H2O2-溶液的混合物。控制组中的动物接受[ 3H]-DA+0. 9% NaCl的混合物。
[0015] 在准备老鼠的生物材料时去除脑，下丘脑和纹状体的两个部分被切除并且被置于 冷的衬垫上（+4°C)，其中所述老鼠在鼻部导入包含[ 3H]-DA的溶液三分钟后被处死。所取 出的脑结构在35s至40s内被称量，在液氮中冷冻并且安置到艾本德试管中。冷冻的样品 冻干48小时长并且紧接着通过200 μ 1 0.1 M的此104溶液萃取。随后将样品在15分钟内 在1000 Og中离心分离并且将上清液用于确定[ 3H-DA]和[3H-DOPAC]。
[0016] 因为样品中的DA和DOPAC的终浓度对于借助于UV检测结合血液的血浆的峰值来 确定该物质的放射性衍生物是不足的，所以由于该原因在色谱分离之前分别将10 μ g未标 记的多巴胺标准品和其代谢产物3, 4-二羟苯乙酸（DOPAC)添加到组织萃取液中。0.1 M的 HClO4中的萃取液的色谱分析在色谱柱Kromasil C18-5 μ m(4X 150mm)中在20°C下借助于 用〇.1%的七氟丁酸中的乙腈（4%至24%)的梯度洗脱来执行。同时对25411111和22〇11111的 波长的检测在贝克曼分光光度计（Modell 165, Altex)上执行，样品体积为100 μ 1。实验组 和控制组的每个动物的、已分开地添加有[3H]-DA和[3H]-D0PAC的脑萃取物的馏分，借助于 液体闪烁计数器来量性分析。
[0017] 在图1上示出包含多巴胺和DOPAC的萃取溶液、下丘脑以及纹状体萃取物的典型 的色谱图。
[0018] 图1.鼠脑的下丘脑和纹状体的色谱分析的萃取物馏分中的[3H]-DA和[ 3H]-DOPAC 的放射性。
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