介孔氧化物纳米颗粒以及制备和使用其的方法
【专利说明】介孔氧化物纳米颗粒以及制备和使用其的方法
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月22日提交的，当前有效的，美国临时专利申请号 61/662,999的优先权，其所公开的内容通过引用并入本申请。
[0003] 关于联邦政府咨助研究的声明
[0004] 本发明在由美国国家科学基金提供的基金号为MPS/DMR-1008125的政府资助下 进行。美国政府享有本发明的一些权益。 发明领域
[0005] 本发明基本涉及具有例如3nm至15nm的尺寸和窄的粒径分布的介孔氧化物纳米 颗粒。特别是，本发明涉及包含此类纳米颗粒的组合物，以及制备和使用此类纳米颗粒的方 法。
【背景技术】
[0006] 癌症已成为世界范围内导致死亡的主要原因，在2008年有超过七百五十万人死 于癌症。并且癌症治疗最重要的形式之一，化疗药物通常也会杀死健康细胞并且对患者产 生毒性。在对改进的替代方案的探求中，纳米运载体已成为用于癌症治疗的新兴平台，其能 够将药物特异性地递送入肿瘤。从20世纪80年代中叶开始，基于聚合物-蛋白缀合物和 脂质的若干类型的靶向纳米运载体已成功进入了临床试验阶段。然而，仍存在很多挑战，包 括迅速清除、暴发式的药物释放和非特异性摄取。为了克服这些问题，需要设计具有更好的 性能的纳米运载体。一种有前景的聚合物的替代性材料是介孔二氧化硅，因为其具有较高 表面积、较好的稳定性和生物相容性。表面功能化的介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN)能够将 多种类型的货物，如DNA、药物分子或者甚至是量子点递送入植物或动物的细胞和组织。然 而，在目前的研发水平下，此类基于MSN的纳米运载体尚未进入临床试验阶段。一个原因是 二氧化硅在生理条件下通常需要非常长的时间溶解，从而导致在机体中可能会出现颗粒的 蓄积，其可能进而导致长期毒性。即使在MSN溶解非常迅速的情况下，在溶出机制、生物分 布和毒性方面仍存在问题。
[0007] 为了获得具有用于临床应用的附加功能例如治疗性质的超小二氧化硅纳米颗粒， 需要开发尺寸小于IOnm的介孔颗粒。尽管近来已将MSN的尺寸降至20nm以下，但是合成 小于IOnm且具有窄的粒径分布的荧光MSN仍富有挑战。
[0008] 发明简沐
[0009] 在一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含聚乙二醇（PEG)功能化 的介孔氧化物（例如二氧化娃）纳米颗粒，所述纳米颗粒具有15nm或更小的平均粒径，至 少90%所述纳米颗粒的粒径在平均粒径的3nm以内，且至少一部分非孔表面至少部分地被 聚乙二醇基功能化。所述氧化物纳米颗粒可以是金属氧化物纳米颗粒、非金属氧化物纳米 颗粒、或金属与非金属混合的纳米颗粒或者其组合。所述纳米颗粒具有多孔性形态并且每 个颗粒可以具有1至5个孔。多个所述纳米颗粒具有单一的孔。
[0010] 所述纳米颗粒可以是功能化的。例如，在所述单个纳米颗粒非孔表面的至少一部 分和在所述单个纳米颗粒孔表面的至少一部分功能化。在所述纳米颗粒非孔表面的至少一 部分和所述孔表面的至少一部分可以具有不同的功能化反应。
[0011] 所述纳米颗粒可以包含分子货物。例如，在包含所述纳米颗粒的组合物中，所述纳 米颗粒的至少一部分包含分子货物。例如，所述分子货物是治疗剂、预防剂或荧光染料。所 述分子货物可以与所述纳米颗粒的至少一部分孔表面和/或非孔表面的共价结合（例如， 通过接头）。所述分子货物可以被隔离于所述纳米颗粒的孔中。
[0012] 在一个方面，本申请提供了一种制备所述聚乙二醇（PEG)功能化的介孔氧化物 (例如，二氧化硅）纳米颗粒的方法，所述纳米颗粒具有15nm或更小的平均粒径，至少90% 所述纳米颗粒的粒径在平均粒径的3nm以内，且至少一部分非孔表面至少部分地被聚乙二 醇基功能化，所述方法包括步骤：a)在具有碱性pH的水性溶剂中形成反应混合物，所述反 应混合物包含：i)表面活性剂，和ii)氧化物前体（例如，二氧化硅前体如TMOS) ;b)将反 应混合物在一定温度下保持一段时间，以形成介孔氧化物（例如，二氧化硅）纳米颗粒；c) 加入PEG功能化的氧化物（例如，PEG功能化的二氧化硅）前体，d)将反应混合物在一定温 度下保持一段时间，以形成PEG功能化的介孔氧化物（例如，二氧化硅）纳米颗粒；e)任选 地，将所述PEG功能化的介孔氧化物（例如，二氧化硅）纳米颗粒在50°C至95°C的温度下 保持0. 5至24小时；f)将反应混合物冷却至室温；和g)从所述纳米颗粒中除去所述表面 活性剂。
[0013] 所述方法还可以包括将所述纳米颗粒功能化的步骤。例如，将所述PEG功能化的 纳米颗粒与缀合了荧光染料的氧化物前体接触，以使得至少一部分所述孔被荧光染料功能 化。在另一个例子中，将所述PEG功能化的纳米颗粒与分子货物接触，以使得至少一部分所 述分子货物被隔离在所述纳米颗粒的孔中。
[0014] 在另一个方面，本申请提供了使用所述（PEG)功能化的介孔氧化物（例如，二氧化 硅）纳米颗粒的方法。所述纳米颗粒能够用于成像方法和分子货物递送方法。
[0015] 例如，一种将分子货物递送至个体的方法，所述方法包括：给予个体组合物，所述 组合物包含聚乙二醇（PEG)功能化的介孔氧化物（例如，二氧化硅）纳米颗粒，所述纳米颗 粒具有15nm或更小的平均粒径，至少90%所述纳米颗粒的粒径在平均粒径的3nm以内，且 至少一部分非孔表面至少部分地被包含分子货物的聚乙二醇基功能化，其中至少一部分所 述分子货物在所述个体中释放。在这种方法中，所述分子货物可以是治疗剂或预防剂。
【附图说明】
[0016] 图1显示了具有不同直径的二氧化硅颗粒的典型透射电子显微镜（TEM)图像： (a)6. 6nm、(b)8. 2nm和（c)9. 3nm。插图显示了相同样品更高放大倍数的图像。（d)涂覆了 PEG链的单孔MSN的示意图。
[0017] 图2显示了由（a)动态光散射（DLS)和（b)TEM图像分析确定的典型颗粒分布。在 DLS中各批次的各数据集均检测三次。
[0018] 图3显示了根据TEM图像分析确定的各颗粒孔数量的典型分布；各数据点均由三 次独立分析取平均值获得。
[0019] 图4显示了 Cy5. 5标记的mC点的典型特征。（a)DLS尺寸测定。（b)Cy5. 5游离染 料（黑色和蓝色的线）和含有Cy5. 5的mC点（红色和绿色的线）的归一化的FCS曲线。 (c)Cy5. 5mC 点的 TEM 图像。
[0020] 图5显示了用于分析颗粒粒径分布的8. 2nm样品的典型TEM图像。（a)、（b)、（C) 描述了使用相同的TEM图像的三个独立的尺寸测定。插图显示了相同图像更高放大倍数的 图像。
[0021] 图6显示了通过TEM测定的8. 2nm样品典型的直径分布。（a)使用相同的TEM图 像的三次独立测量的结果。（b)用柱状图和带有标记的线图显示带有标准误差的最终的平 均分布以用于比较。
[0022] 图7显示了 Cy5. 5游离染料（黑色的线）和Cy5. 5标记的mC点（红色的线）典 型的吸收（a)和发射（b)光谱。
[0023] 图8显示了不同放大倍数的9. 3nm颗粒的典型TEM图像。
[0024] 图9显示了具有不同粒径和形态的超小介孔二氧化硅纳米颗粒合成流程的示例。
[0025] 图10显示了通过DLS检测的在不同反应条件下合成的所制备的颗粒的平均直径 的典型图谱。各样品均被测量三次，然后对结果取平均值。
[0026] 图11显示了在不存在（方块）和存在（圆圈）PEG_硅烷的条件下在颗粒生长期 间通过DLS测定的典型颗粒的直径。各数据点均由三次独立测量取平均值获得。
[0027] 图12显示了（a)通过DLS测得的在不同反应条件下合成的经洗涤的颗粒的平均 直径的图谱。各样品均被测量三次，然后对结果取平均值。（b)所选定样品的DLS测量结果 以（a)中的蓝色数字表示。
[0028] 图13显示了具有不同平均直径的二氧化硅颗粒的典型TEM图像：（a)5. 6nm、 〇3)7.6]1111、（(3)10.6111]1和（(1)13.6111]1。插图显示了相同样品更高放大倍数的图像 。
[0029] 图14显示了在以氢氧化铵作为催化剂的不同反应条件下合成的经洗涤的颗粒的 平均直径的图谱。通过动态光散射（DLS)测定各样品的平均直径。各样品均被测量三次， 然后对结果取平均值。
[0030] 图15显示了具有不同平均直径的二氧化硅颗粒的典型TEM图像：（a)6. 6nm、 (b)7.3nm、（c)8.2nm、（d)9.3nm、（e)10.2nm、（f)11.3nm、（g)12.1nm、（h)13.5nm 和 (i) 15. 9nm。插图显示了相同样品更高放大倍数的图像。
[0031] 图16显示了典型的（a)使用氢氧化铵作为催化剂合成的具有不同平均直径的所 选定颗粒的DLS测定结果。（b) TEM图像分析确定的孔数量/颗粒的分布。
[0032] 图17显示了通过TEM图像分析确定的典型粒径分布。插入的TEM图像（上部） 将颗粒形态与尺寸相联系。利用颜色标识导致相同的颗粒形态的尺寸范围。