一种具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]近年来，随着纳米医药科学的快速发展，构建集多重治疗与成像诊断于一体的多功能诊疗平台已成为目前的癌症治疗的发展趋势。稀土掺杂上转换发光纳米粒子，由于能在近红外光的激发下，产生多波段可见光及紫外光区域的发射，(其中某一波段光用于成像，其它波段光用于治疗)，因而在构建多功能癌症的诊疗平台中备受重视。目前基于上转换纳米材料诊疗平台的研宄报导均为双层核-壳结构的两功能平台，将单一的治疗与诊断成像整合到一起，具体可分为两大类:1、光动力治疗与细胞成像相结合:制备以上转换纳米粒子为核，外层包覆介孔二氧化硅为壳的核壳结构，将光敏剂负载于介孔二氧化硅的孔道内。在近红外光的照射下，上转换纳米粒子能将近红外光转化为几种特定波长的光，其中一部分波长光被光敏剂吸收产生单线态氧，可以直接杀死癌细胞，称之为光动力治疗；而另一波段的光则可用于细胞荧光成像。但对于该平台而言，介孔内负载的光敏剂可能存在团聚或泄漏的问题，这将极大地降低单线态氧产生的效率，且泄漏的光敏剂会杀伤正常细胞，产生毒副作用；2、药物释放化学治疗与细胞成像相结合:采用与上述平台相类似的核-壳结构，不同之处在于外层介孔二氧化硅孔道内装载的是抗癌药物而非光敏剂。在近红外光的照射下，上转换纳米粒子将近红外光转化为特定波长的光，用于光学细胞成像。与此同时，孔道内的药物分子通过分子扩散的形式得以释放，达到癌症诊断和治疗的目的。利用该平台进行药物输送时，孔道内负载的药物随血液循环在到达癌细胞富集区前不应泄露或释放，否则会杀伤正常细胞。
[0003]以上二种癌症诊疗平台为避免抗癌药或光敏剂的泄漏杀伤正常细胞，通常需要设计智能响应的控释开关体系，以便在细胞成像监控下，当纳米粒子随血液循环到达癌细胞富集区时，触发开关，实现定时、定位的光动力治疗或药物释放，在提尚疗效的同时将副作用降到最小。目前为多功能平台设计的控释体系主要基于PH、温度、酶、光等几种智能响应方式。其中PH、温度、酶响应-为体内控释，响应灵敏度差，难以精确调控。而光响应体系因具有体外控释、响应灵敏性高、并可通过光波长、功率及光照时间精确调控等特点而备受青睐。但紫外光和可见光因其穿透力弱及对细胞组织可能造成损伤等因素，在实际应用中受到限制。近红外光由于生物体穿透力强、对细胞损伤小，被认为是光响应控释的最理想光源，基于上转换纳米粒子实现近红外响应控释被认为是目前平台控释设计的重要挑战之
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【发明内容】
[0004]本发明是为了解决现有方法无法同时进行细胞成像、光动疗和光控释药的问题，而提供了一种具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的制备方法。
[0005]一种具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的制备方法具体是按以下步骤进行的:
[0006]一、将NaYF4:Yb/Er上转换纳米粒子分散于环己烷中，得到上转换纳米粒子核；
[0007]二、将表面活性剂C0-520在室温下溶解在环己烷中磁力搅拌15min?30min，得到混合液，将步骤一得到的上转换纳米粒子核、光敏剂和氨水加入到混合液中在室温下搅拌20min?40min ;然后逐滴加入四乙氧基硅烷，在室温下搅拌20h?26h，离心分离得到固体物，固体物用乙醇清洗3?5次，然后分散到去离子水中，得到包覆有光敏剂的上转换纳米粒子;
[0008]三、将步骤二得到的包覆有光敏剂的上转换纳米粒子加入到阳离子表面活性剂中，在室温下搅拌25min?40min之后超声25min?40min，然后加入氢氧化钠溶液继续超声25min?40min，然后通过蠕动泵将四乙氧基硅烷与乙醇的混合溶液以0.5mL/h的速度加入到反应体系中，反应液在温度为30?40°C的条件下反应20h?26h，反应结束后通过离心分离，得到固体物，用乙醇清洗固体物3?5次，然后在真空干燥箱中室温干燥12h，得到未除去表面活性剂的固体产物；
[0009]四、将步骤三得到的未除去表面活性剂的固体产物分散到干燥的甲苯中，然后加入硅烷偶联剂，在氮气保护的情况下加热回流24h后，离心分离，得到固体，采用甲醇清洗固体3?5次后，放入真空干燥箱在室温下干燥12h，得到表面胺基修饰的三层硅球；
[0010]五、将步骤四得到的表面胺基修饰的三层硅球分散在甲醇溶液中，然后向其中加入浓盐酸，在温度为70°C、搅拌的条件下加热回流24h，反应结束后离心分离，得到固体，采用甲醇清洗固体3?5次后，放入真空干燥箱在室温下干燥24h，得到胺基修饰的介孔硅球；
[0011]六、将步骤五得到的胺基修饰的介孔硅球分散到二甲亚砜中，超声25min?40min，得到分散好的纳米粒子溶液，然后将单线态氧加入到分散好的纳米粒子溶液中，再将1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐加入到分散好的纳米粒子溶液中，最后将N-羟基丁二酰亚胺加入到分散好的纳米粒子溶液中，反应体系在室温下反应24h，通过离心的方式分离，然后用水洗涤3?5次再用甲醇清洗3?5次，在真空干燥箱中室温干燥12h，得到修饰了单线态氧敏感分子的纳米粒子；
[0012]七、将步骤六得到的修饰了单线态氧敏感分子的纳米粒子分散到N，N- 二甲基甲酰胺中超声25min?40min，得到分散液，然后将1-胺基金刚烷加入到分散液中，再将1_乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐加入到分散液中，最后将N-羟基丁二酰亚胺加入到分散液中，反应体系在室温下搅拌反应24h，通过离心的方式分离，然后用水洗涤3?5次再用甲醇清洗3?5次，在真空干燥箱中室温干燥12h，得到客体分子金刚烷修饰的纳米粒子；
[0013]八、将步骤七得到的客体分子金刚烷修饰的纳米粒子加入到罗丹明B溶液中，超声25min?40min，反应体系在室温下搅拌反应24h，然后向反应体系中加入β -环糊精，反应体系在室温下搅拌反应48h，反应结束后将载药后的纳米粒子离心分离，固体用pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液清洗3?5次，在真空干燥箱中室温干燥12h，得到具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体。
[0014]本发明的有益效果:
[0015]本发明利用特殊设计的三层核-壳结构纳米粒子作为癌症诊疗平台，三位一体实现光控释药、光动疗、细胞成像。该平台任意搭载各种药物，可以实现各种药物化学治疗与光动力治疗的复合治疗(鸡尾酒疗法)，从而避免单一治疗方式癌细胞耐药性与抗药性的产生。同时利用近红外光具有的穿透深、低毒性的特点，结合上转换纳米粒子搭建具有近红外响应的多功能癌症诊疗平台，利用近红外光作为触发开关，实现在细胞成像监控下，定时、定位的光动力治疗与光控药物释放。药物控释精度高，操作简单，可以达到药物缓释效果，延长药物作用时间，减少用药次数。
[0016]本发明设计的三层核-壳结构，增加了中间实心硅壳，用来以包覆方式负载光敏剂，由于避免了光敏剂团聚及泄漏问题，提高了有效光敏剂负载量。一方面有利于提高细胞成像清晰度，同时增加了单线态氧的产率，可以有效杀死癌细胞，保证光动疗的疗效，同时还有利于基于产生的单线态氧光控断键，释放药物。
【附图说明】
[0017]图1为实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的透射电镜图；
[0018]图2为实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的透射电镜局部放大图，其中I为上转换纳米粒子，2为包埋光敏剂的实心二氧化硅，3为装载抗癌药的介孔二氧化硅；
[0019]图3为实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的氮气吸脱附曲线；
[0020]图4为实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体中装载抗癌药的介孔二氧化硅的介孔孔径分布曲线；
[0021]图5为980nm近红外激光激发下实施例二制备的未包覆光敏剂亚甲基蓝的三层核壳纳米粒子的发射光谱图；
[0022]图6为980nm近红外激光激发下实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体的发射光谱图；
[0023]图7为980nm近红外激光照射下实施例一步骤六中所述单线态氧产生的浓度随时间变化曲线，其中a为未修饰单线态氧的介孔硅球，b为修饰单线态氧的介孔硅球，c为未光照的未修饰单线态氧的介孔硅球；
[0024]图8为不同功率近红外光照射时的实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体药物释放效果图，其中a为未光照的实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体药物释放曲线，b为近红外光功率为0.5W/cm2时实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体药物释放曲线，c为近红外光功率为1.5W/cm2时实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体药物释放曲线，d为近红外光功率为2W/cm2时实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体药物释放曲线，e为近红外光功率为3W/cm2时实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体药物释放曲线，I为光照停止位置；
[0025]图9为近红外光功率为2W/cm2时对实施例一制备的具有近红外光远程响应的三层核-壳结构药物载体间歇性照射时的药物模