一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及骨组织工程领域，特别涉及一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法。
【背景技术】
[0002]骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stromal cells，BMSCs)具有体外易增殖、多向分化、分泌促生长因子及免疫调节的能力，是当前最理想的骨组织工程种子细胞，可以用来修复骨缺损。但是，在无成骨诱导的情况下，将BMSCs单独注射入体内，其并不能在体内实现成骨转化，无法有效修复骨缺损。
[0003]研宄表明，通过转基因技术或重组蛋白技术在BMSCs的基因组中加入成骨基因或骨形态发生蛋白-2 (BMP-2)，骨形态发生蛋白7 (BMP-7)，再将BMSCs结合于成骨支架植入动物体内，可以修复自体不能愈合的临界骨缺损。其中，通过转基因技术干预BMSCs已在动物体内取得了良好的成骨效果，但这种通过转基因增强BMSCs体内成骨的技术并不适用于临床。因为该技术使用腺病毒，质粒等载体将外源基因导入患者的BMSCs，改变了患者本身BMSCs的基因型，存在较大的生物安全隐患，可能产生不可预见的生物学后果。而采用重组蛋白技术，通过在BMSCs的基因组中加入BMP-2，BMP-7等成骨蛋白来促进BMSCs向成骨分化，由于BMP-2，BMP7本身成骨作用过强，效果无法调控，潜在的致瘤性，未获得国内CFDA卫生安全批号。
[0004]为解决上述的转基因技术或重组蛋白技术的安全性问题，人们开始研宄利用地塞米松，抗坏血酸及甘油磷酸钠配所组成的成骨诱导分化液在体外诱导BMSCs向成骨分化，然后再将有成骨分化倾向的BMSCs结合于成骨支架植入动物体内，修复骨缺损。但是，有成骨分化倾向的BMSCs在体内想要完成成骨转化，还要继续接受成骨诱导分化液的诱导，因此成骨支架一般采用具有多孔特性的材料，例如羟基磷灰石，羟基磷灰石的孔隙可以吸附一定量的成骨诱导分化液从而在体内继续促进BMSCs的成骨转化。但是，吸附在羟基磷灰石孔隙中的成骨诱导分化液在体内很快被血液稀释，其成分中的地塞米松在血液中的半衰期仅为90分钟，抗坏血酸在体内迅速被氧化。因此，上述传统成骨诱导液不能在体内长期稳定的促进BMSCs成骨分化。同时，大量的研宄已经证明，地塞米松尽管能够促进BMSCs成骨转化，但是会抑制BMSCs的增殖，并不利于骨缺损的修复。
【发明内容】
[0005]为解决上述问题，本发明实施例公开了一种三维细胞培养平台、其制备方法及其使用方法。技术方案如下:
[0006]一种三维细胞培养平台，包括:成骨支架，聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球，胰岛素；所述成骨支架为网状结构，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球附着于所述成骨支架上，所述胰岛素包裹于所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球中，基于所三维细胞培养平台的总质量，所述胰岛素的质量分数为0.5%。?5%。，优选为0.5%。?3%。，更优选为0.5%0?1%0ο
[0007]其中，所述成骨支架的孔隙率为80%?85%，孔径大小为100?200 μm。
[0008]其中，基于所述三维细胞培养平台的总质量，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的质量分数为0.5%?5%，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球的粒径I?5 μπι。
[0009]一种制备如权利要求1所述的三维细胞培养平台的方法，包括以下步骤:
[0010](I)制备含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球
[0011]将胰岛素和琥珀酰明胶溶解于pH值为1.5?3的乙酸水溶液中作为第一水相W1，将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于二氯甲烷溶剂中作为油相O，将聚乙烯醇和氯化钠溶解于水中第二水相W2 ;其中，琥珀酰明胶和胰岛素的质量比为1:(3?8);胰岛素与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的质量比为1: (5?15)；
[0012]将第一水相Wl和油相O进行初乳化，制成Wl/Ο型初乳液；将ffl/Ο型初乳液与第二水相W2进行复乳化，制成W1/0/W2型乳液；
[0013]将制得的W1/0/W2型乳液稀释于水中，通过离心得到含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球；
[0014](2)制备成骨支架
[0015]将质量比为1:(1.5?3)的牛腱胶原和羟基磷灰石分别溶解于乙酸中，制成牛腱胶原乙酸溶液和羟基磷灰石乙酸溶液；在O?5°C的条件下，将羟基磷灰石乙酸水溶液加入到牛腱胶原乙酸水溶液中，得到混合溶液，并调节混合溶液的PH值为7.2±0.2 ;加入戊二醛水溶液，搅拌均匀后真空脱气，然后在-20?_30°C的条件下静置15?30小时以形成成骨支架，最后将成骨支架真空干燥；
[0016](3)制备三维细胞培养平台
[0017]将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球分散于中性磷酸盐缓冲溶液中，然后向其中加入成骨支架，所述含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球与成骨支架的质量比为1: (10?20)，采用负压抽吸法将含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球吸入成骨支架的网状结构，干燥，得到三维细胞培养平台。
[0018]其中，用于溶解牛腱胶原和羟基磷灰石的乙酸水溶液的pH值为2?5。
[0019]其中，所述第一水相Wl中，胰岛素的浓度为1:(10?20)mg/mL ;所述第二水相W2中聚乙稀醇和氯化钠的浓度分别为(5?15)mg/mL和(5?15)mg/mL。
[0020]其中，初乳化时，乳化线速度为20?40m/s，乳化时间为30?10s ;复乳化的乳化的线速度为0.6?1.5m/s，乳化时间为30?10s0
[0021]其中，含有胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球质量与磷酸盐缓冲溶液的体积比为:(2?8):lmg/mLo
[0022]其中，得到三维细胞培养平台后，将其按要求大小或骨缺损形状进行切割，经过钴60辐照灭菌后，得到无菌的三维细胞培养平台。
[0023]上述的三维细胞培养平台的使用方法，包括:
[0024]将骨髓间充质干细胞重悬以1Vcm3接种于三维细胞培养平台；
[0025]将接种了骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台整体放入培养瓶中，加入L-DMEM培养基+5%胎牛血清，37°，5%0)2;骨髓间充质细胞I?4小时后完成贴壁；体外培养I?3天后细胞即可长至70%;在无菌操作条件下，将包含骨髓间充质干细胞的三维细胞培养平台直接置入骨缺损区，无张力缝合。
[0026]本发明通将羟基磷灰石，胶原和载胰岛素的聚乳酸-羟基乙酸共聚物缓释微球混合制作成一种可以持续释放胰岛素的三维细胞培养平台。利用该三维细胞培养平台进行BMSCs培养时，BMSCs的细胞活力，成骨因子的表达显著高于羟基磷灰石等常规材料，因此可以实现持续促进BMSCs成骨分化。该细胞培养平台所用原料均为临床已证明安全可降解，可直接裁剪成骨缺损形态。接种BMSCs后既可体外模拟自然骨培养，也可直接植入体内修复骨缺损，体内良好的成骨效果已在动物模型中得到证明。
【附图说明】
[0027]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为胰岛素释放曲线；其中，图1A为市售羟基磷灰石真空吸入吸入胰岛素的的释放曲线；图1B为实施例1制备三维细胞培养平台的胰岛素释放曲线；
[0029]图2为接种BMSCs前、后的纳米羟基磷灰石和三维细胞培养平台的扫描电镜图；其中，A为接种BMSCs前羟基磷灰石的扫描电镜图；B为接种BMSCs前实施例1制备三维细胞培养平台的扫描电镜图；C为接种BMSCs前羟基磷灰石的高倍镜下的扫描电镜图；D为接种BMSCs前实施例1制备三维细胞培养平台的高倍镜下的扫描电镜图；E为接种BMSCs后的羟基磷灰石的扫描电镜图；F为接种BMSCs后实施例1制备三维细胞培养平台的扫描电镜图；
[0030]图3为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台中的生长曲线；
[0031]图4为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上的成骨基因表达结果示意图；
[0032]图5为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上的ALP含量与时间的关系图；
[0033]图6为BMSCs在羟基磷灰石和实施例1制备的三维细胞培养平台上的OCN含量与时间的关系图。
【具体实施方式】
[0034]发明人在实验过程中意外的发现，在一定浓度范围内胰岛素可同时促进BMSCs增殖和成骨分化，且这种促进作用随胰岛素作用时间的延长而持续增强。因此，可以用胰岛素来代替现有的含有地塞米松的成骨诱导分化液。但是，胰岛素在血中的半衰期只有不到十分钟，而对骨修复过程中骨初级骨是从缺损后的7到14天开始出现，约三个月才能完成骨痂的改建达到临床愈合的标准。为了避免在临床中对患者反复局部注射胰岛素，需要一种能够长期稳定缓释胰岛素的生物材料，和BMSCs —起植入骨缺损增强BMSCs对骨缺损的修复。
[0035]羟基磷灰石是常见的用作成骨支架的材料，采用真空吸附法直接负载胰岛素后测试其缓释能力，结果发现缓释时间均不足一周，即在骨修复尚未完全开