一种复合支架材料的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种复合支架材料。
【背景技术】
[0002] 骨缺损是指由于创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病导致的骨 结构完整性被破坏的疾病，是临床常见病和多发病。对于骨缺损的治疗主要通过自体骨移 植、异体骨移植、人工骨移植、组织工程骨移植、骨搬运技术等。其中，使用自体骨和人工骨 的移植术各有不足。自体骨的来源有限、术中额外失血及手术麻醉的时间较长以及可能出 现供区骨折、骨痛等并发症；异体骨或人工骨虽然来源相对比较广泛，但是只能提供被动的 支架功能，植入后新骨的爬行替代过程缓慢，骨不愈合率相对较高，具有传播疾病的危险， 存在发生免疫排斥反应的可能性。组织工程骨的发展，正是解决这个难题的可行方向。
[0003] 组织工程骨技术自20世纪80年代诞生以来为广大骨缺损患者的治疗带来新的选 择，其是利用组织工程的手段，构建、培育活的骨组织，以修复或重建骨的结构。组织工程骨 是一种人工制备的含有活体细胞的骨替代材料，它能形成新的功能性骨组织，可以修复大 块骨缺损，它还可按需塑形及大量制备，是理想的骨修复材料。骨组织工程要求种子细胞应 具备较强的增殖能力和良好的成骨功能。目前用的较多的种子细胞即是骨髓间充质干细 胞，它的优点是取材方便，体外培养扩增后细胞数量充足，进行自体移植而不存在免疫排斥 问题，目前在临床中应用广泛，被认为是骨组织工程中较理想的种子细胞。
[0004] 但是骨髓间充质干细胞来源有限，含量较低，骨髓的抽取需要骨穿刺才能获得，对 机体造成的创伤较大，而且骨髓来源有限，其中含有复杂的细胞成分，干细胞在其中的含量 较低，需要较长的周期在体外扩增培养。因此，骨髓间充质干细胞在临床上应用范围较窄。 同时本研宄发现骨髓间充质干细胞存在成骨分化能力较低的问题，与支架材料的复合能力 差，矿化结节困难，这会进一步影响治疗骨缺损的效果。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种复合支架材料。该复合支架材料采用牙髓干细胞作 为种子细胞，并将其与壳聚糖和I型胶原联合制成，通过体外成骨诱导试验，表明牙髓干细 胞比骨髓干细胞具有更好的成骨分化能力，牙髓干细胞和支架材料能够紧密结合，并且牙 髓干细胞在支架材料中生长良好，能够更好地应用于骨缺损的治疗。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了一种复合支架材料，其制备方法包括如下步骤：
[0008] 步骤A :将壳聚糖溶液和I型胶原溶液混合，保持pH值酸性，获得壳聚糖/1型胶 原复合物；
[0009] 步骤B :将壳聚糖/1型胶原复合物与交联剂混合，冷冻干燥，获得多孔支架；
[0010] 步骤C :将多孔支架浸泡于无血清培养基中，去除无血清培养基，加入牙髓干细胞 悬液，静置，加入完全培养基进行细胞培养，获得复合支架材料。
[0011] 本发明通过研宄发现：从乳牙中通过胶原酶消化提取的牙髓干细胞比骨髓干细胞 具有更强的成骨分化能力，将其接种到支架材料中，利用扫描电镜观察到其能够很好的生 长，保持细胞原有的特性，能够更好地应用于骨缺损的治疗。
[0012] 作为优选，壳聚糖、I型胶原、交联剂的质量比为（1~5) : (2~8) : (1~3)。
[0013] 优选地，壳聚糖、I型胶原、交联剂的质量比为3 :2 :1。
[0014] 作为优选，牙髓干细胞悬液的细胞密度为（I. 0~2. 0) X 105/mL。
[0015] 作为优选，牙髓干细胞为乳牙牙髓干细胞。乳牙作为一种自然脱落的人体器官，包 含了一种特殊的干细胞。它不仅有非常易得的组织来源，而且能为大量的临床需求提供足 够的细胞；由于是自生组织，不产生免疫排斥反应，具有较高的安全性。
[0016] 在本发明提供的一些实施例中，牙髓干细胞的制备方法为：采用胶原酶对牙髓组 织进行消化，离散细胞团块，接种，加入表皮生长因子EGF，在37°C、湿度为95%、C0 2条件下 进行细胞培养。
[0017] 作为优选，在牙髓干细胞制备方法中，牙髓组织为牙髓组织根尖部Imm的组织。
[0018] 作为优选，胶原酶为I型胶原酶。
[0019] 作为优选，以cmVmL计，多孔支架与牙髓干细胞悬液的比例为（0. 05~0. 2) : (2~ 3) 〇
[0020] 为了保证干细胞充分附着于多孔支架，作为优选，步骤C中静置的时间为24~ 72h〇
[0021] 优选地，步骤C中静置的时间为48h。
[0022] 作为优选，步骤C中细胞培养的时间为IOd~20d。
[0023] 作为优选，细胞培养的时间为14d。
[0024] 在本发明提供的一些实施例中，壳聚糖溶液为3%~5%的壳聚糖溶液。
[0025] 作为优选，壳聚糖溶液为4%的壳聚糖溶液。
[0026] 在本发明提供的一些实施例中，壳聚糖溶液为将壳聚糖溶于盐酸溶液中形成的溶 液。也可将壳聚糖溶于醋酸溶液中形成壳聚糖溶液。
[0027] 在本发明提供的一些实施例中，I型胶原溶液的质量体积含量为5~15mg/mL。
[0028] 作为优选，I型胶原溶液的质量体积含量为10mg/mL。
[0029] 在本发明提供的一些实施例中，I型胶原溶液为将I型胶原溶于水中形成的溶液。
[0030] 在本发明提供的一些实施例中，步骤B中混合的时间为0. 5h~lh。
[0031] 作为优选，步骤B中混合的时间为0. 5h。
[0032] 作为优选，步骤C中浸泡的时间为24h~48h。
[0033] 优选地，步骤C中浸泡的时间为24h。
[0034] 在本发明提供的一些实施例中，牙髓干细胞为Pl~P3代牙髓干细胞。
[0035] 在本发明提供的一些实施例中，将壳聚糖溶液和I型胶原溶液混合，保持pH值在 4~5之间，获得壳聚糖/1型胶原复合物。
[0036] 本发明提供了一种复合支架材料。该复合支架材料的制备方法包括如下步骤：将 壳聚糖溶液和I型胶原溶液混合，保持PH值酸性，获得壳聚糖/1型胶原复合物；将壳聚糖/ I型胶原复合物与交联剂混合，冷冻干燥，获得多孔支架；将多孔支架浸泡于无血清培养基 中，去除无血清培养基，加入牙髓干细胞悬液，静置，加入完全培养基进行细胞培养，获得复 合支架材料。本发明至少具有如下优势之一：
[0037] 牙髓干细胞成骨分化能力强：通过体外成骨诱导试验，表明牙髓干细胞比骨髓干 细胞具有更好的成骨分化能力，牙髓干细胞和支架材料能够紧密结合，并且牙髓干细胞在 支架材料中生长良好，能够更好地应用于骨缺损的治疗；
[0038] 牙髓干细胞来源丰富：6~11岁的小孩自然脱落的牙齿中、成人需要拔掉的智齿 中都含有丰富的牙髓干细胞；
[0039] 牙髓干细胞副作用小：牙髓干细胞是一种间充质干细胞，具有间充质干细胞的通 性，不仅免疫原性低，无须经过严格配对即可使用，不会引起强烈的排异反应，而且还具有 免疫调节功能；
[0040] 牙髓干细胞无伦理争议：因牙髓干细胞取自小孩自然脱落的牙齿及成人的智齿， 属于废弃物品，且不损及生命，不存在伦理上的争议。
【附图说明】
[0041] 图1示牙髓干细胞原代细胞培养图片（100X);其中，I-A示培养Id时的细胞形 态；I-B示培养3d时的细胞形态，I-C示培养8d时的细胞形态；
[0042] 图2示骨髓干细胞原代细胞培养图片（100X);其中，2-A示培养Id时的细胞形 态；2-B示培养4d时的细胞形态，2-C示培养IOd时的细胞形态；
[0043] 图3示牙髓干细胞和骨髓干细胞成骨诱导后细胞形态变化（100X);其中，3-A示 对照组干细胞培养d的细胞形态；3-B示牙髓干细胞诱导24d后的细胞形态；3-C示骨髓干 细胞诱导28d后的细胞形态；
[0044] 图4示DMPl的表达情况；
[0045] 图5示SOST的表达情况；
[0046] 图6示扫描电镜观察支架材料；其中，6-A为支架材料；6-B为含有牙髓干细胞的 支架材料，其中箭头所指为牙髓干细胞。
【具体实施方式】
[0047] 本发明公开了 一种复合支架材料，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进 工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而 易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描 述，相关人员明显能在不脱离本