纽兰格林制剂的配方的制作方法
【技术领域】
[0001] -般来说，本发明涉及治疗心血管疾病比如心力衰竭的药物制剂。特别地，本发明 涉及纽兰格林药物制剂的配方。
[0002] 发明背景
[0003] 在美国，大约有5百万人患有心衰，并且每年新增病人在55万以上。目前治疗心 衰的药物主要集中于血管紧张素转化酶（ACE)抑制剂，这些血管舒张剂引起血管扩张、降低 血压并减少心脏负荷。虽然使用ACE抑制剂后死亡率的百分数下降是具有统计学差异的， 但实际的死亡率仅平均下降3%_4%，并且还有一些潜在的副作用。其他预防或治疗心衰的选 择亦有相应的局限。比如，心脏移植显然比药物治疗更昂贵且更具侵入性，并且还进一步受 有无供体心脏的限制。使用机械装置，比如双心室心脏起搏器，同样具有侵入性并且比较昂 贵。因此，由于当前治疗手段的不足，人们需要有新的治疗方法。
[0004] -种很有前途的新的治疗手段涉及给心衰患者或有心衰风险的患者施用纽兰格 林(此后称为"NRG")。NRGs属于表皮生长因子样（EGF-Iike)家族，是一类结构上相似的生 长分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其异构体。NRGs涉及一系列生物学反应：刺 激乳腺癌细胞分化和分泌乳汁蛋白；诱导神经嵴细胞分化成Schwann细胞；刺激骨骼肌细 胞合成乙酰胆碱受体；并且促进心肌细胞成活和DNA合成。用纽兰格林基因严重缺陷的纯 合子小鼠胚胎做活体研究证明纽兰格林对于心脏和神经发育是必须的。
[0005] NRGs与EFG受体家族的成员结合，该受体家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4， 其中每一个受体在多种细胞功能中都发挥重要的作用，包括细胞生长、分化和存活。它们都 是蛋白酪氨酸激酶受体，由一个胞外配体结合域、跨膜激酶域和胞浆的酪氨酸激酶结构域 组成。NRG结合至ErbB3或ErbB4的细胞外结构域后，能够诱导构象改变从而引起ErbB3、 ErbB4和ErbB2之间形成异二聚体，或者ErbB4自身形成同源二聚体，这样就会导致受体细 胞内C-末端结构域的磷酸化。然后磷酸化的胞内结构域与细胞内其他的信号蛋白结合，活 化相应的下游AKT或ERK信号传导途径，并诱导一系列的细胞反应，比如刺激或抑制细胞增 殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞粘附。在这些受体中，ErbB2和ErbB4主要在心脏 表达。
[0006] 已有研究表明NRG-I的EGF类似区，约50至64个氨基酸，足以结合并活化这些受 体。以前的研究表明纽兰格林-1 β (NRG-1 β )能以高亲和力直接结合ErbB3和ErbB4。孤 儿受体ErbB2能与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体并且其亲和力比ErbB3或ErbB4同源二 聚体要高。神经发育的研究结果提示交感神经系统的形成需要完整的NRG-I β、ErbB2和 ErbB3信号传导系统。靶向破坏NRG-I β、或ErbB2或ErbB4后由于心脏发育缺陷而导致胚 胎致死。最近的研究也突显了 NRG-I β、ErbB2和ErbB4在心血管发育以及维持成年正常心 脏功能方面具有重要作用。研究表明NRG-I β能增强成年心肌细胞的肌小节的组织结构。 短期施用一种重组的NRG-I β EGF类似区能显著改善或防止不同心衰动物模型的心肌功能 的恶化。这些效应使得NRG-I有望成为一种治疗多种普通疾病导致的心衰的广谱治疗物或 先导化合物。通常，蛋白质类药物制剂的给药方式为静脉注射。然而众所周知，一些活性蛋 白存在着稳定性差的问题。因此，开发一种稳定的纽兰格林药物制剂是非常必要的。
[0007] 发明概述
[0008] 本发明所提供的一种纽兰格林的药物配方包含：（a)纽兰格林多肽；（b) -种缓冲 齐Ll，使所述配方pH值为3-7。在一些实施例中，纽兰格林配方进一步包括：（c)一种稳定剂。 在一些实施例中，纽兰格林还包括：（d)-种盐。在一些实施例中，该配方为一种液体制剂。 在一些实施例中，该配方为一种冻干制剂。
[0009] 配方中所述纽兰格林多肽选自以下物质：a) -种包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序 列的多肽；b)-种包含纽兰格林的EGF类似区的多肽；c)一种a)所述多肽的生物活性类似 物，片段或突变体；d) -种由SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列编码的多肽；e) -种d)所述多 肽的生物活性类似物，片段或突变体；f)一种由可在适度严格的杂交条件下与SEQ ID NO: 1 所示多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的多肽。在一些实施例中，纽兰格林多肽是指包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽。在一些实施例中，纽兰格林多肽的浓度范围约为0.0 lg/ L-lg/L。在一些实施例中，本发明所述配方中纽兰格林多肽为包含SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列的多肽且浓度约为〇. 25g/L。
[0010] 在一些实施例中，本发明所述配方包含一种pH缓冲剂。在所述实施例中，pH缓冲 剂的浓度范围约为0. lmM-500mM。缓冲剂选自柠檬酸盐，磷酸盐，醋酸盐，组氨酸，甘氨酸，碳 酸氢盐，HEPES，Tris，稀盐酸，稀氢氧化钠溶液或以上物质的组合。在一种实施例中，本发明 所述配方中的缓冲剂是磷酸盐。在一些实施例中，本发明所述配方的pH值约为6.0。在一 些实施例中，本发明所述配方的pH值约为3. 4。
[0011] 在一些实施例中，本发明所述配方包含一种稳定剂。在进一步的实施例中，稳定剂 的浓度范围约为0. lg/L-200g/L。在另外的实施例中，稳定剂选自甘露醇，山梨醇，木糖醇， 蔗糖，海藻糖，甘露糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，棉子糖，纤维二糖，龙胆二糖，异麦芽糖，阿拉 伯糖，葡萄糖胺，果糖，人血清白蛋白及或以上物质的组合。在一些实施例中，稳定剂指浓度 约为2g/L的人血清白蛋白。
[0012] 在另外一些实施例中，本发明所述配方包含一种盐。在一些实施例中，盐的浓度约 为100mM-500mM。在一特定实施例中，盐是指氯化钠。在相关实施例中，配方中盐的浓度约 为 150mM。
[0013] 在一些实施例中，本发明所述配方中的纽兰格林多肽包含SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列，其中缓冲剂约为IOmM的磷酸盐，pH值约为6. 0。
[0014] 在一些实施例中，本发明所述配方中所含的NRG多肽是SEQ ID NO:2所示氨基 酸序列的多肽且浓度约为〇. 25g/L，所含的缓冲剂是浓度约为IOmM的磷酸盐且pH值约 为6.0,所含的稳定剂是浓度约为2g/L的人血清白蛋白，所含的盐是氯化钠且浓度约为 150mM〇
[0015] 在一些实施例中，本发明所述配方是液体药物制剂。在进一步实施例中，本发明所 提供的纽兰格林液体药物制剂配方包含的纽兰格林多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的 多肽且浓度约为0. 25g/L，所述缓冲剂约为IOmM磷酸盐且其中所述pH约为3. 4。
[0016] 在一些实施例中，本发明所述配方是由上述任一配方加入赋形剂后冻干而成的冻 干药物配方。在一些实施例中，赋形剂选自人血清白蛋白，甘露醇，甘氨酸，聚乙二醇或以上 物质的组合。在一特定实施例中，赋形剂为甘露醇。在相关实施例中，约60mg的所述配方 用Iml重悬溶液重悬后赋形剂的浓度约为0. lg/L-200g/L。在一特定实施例中，约60mg的 所述配方用Iml重悬溶液重悬后甘露醇的浓度约为50g/L。
[0017] 在进一步实施例中，本发明所提供的纽兰格林冻干药物配方包含：（a) -种纽兰 格林多肽；（b) -种缓冲剂；（c) 一种赋形剂。在另外一些实施例中，冻干的药物制剂配方 进一步包含一种稳定剂。在另外一些实施例中，冻干的药物制剂配方进一步包含一种盐。
[0018] 在一特定实施例中，本发明所述的冻干药物制剂配方包含：（a)SEQ ID N0:2所示 氨基酸序列的多肽；(b)磷酸盐缓冲剂；（c)赋形剂甘露醇；（d)稳定剂人血清白蛋白和（e) 盐氯化钠，约60mg的所述配方用Iml重悬溶液重悬后（a)的浓度为0. 25g/L ; (b)的浓度为 IOmM且pH值约为6 ; (c)的浓度为50g/L ; (d)的浓度为2g/L ; (e)的浓度为150mM。
[0019] 附图简述
[0020] 图1 :重组人纽兰格林（rhNRG-Ι)稀释液和浓度为0· 25mg/mL标准溶液的色谱图
[0021] 图 2 :pH3-10 的 SDS-PAGE 色谱图
[0022] 图3 :在温度为40°C、pH3_8条件下的浓度-时间图
[0023] 图4 :在温度为40°C、pH2. 3-4. 3条件下的浓度-时间图
[0024] 图5 :在温度为50°C、pH2. 3-4. 3条件下的浓度-时间图
[0025] 图6 :在温度为60°C、pH3_8条件下的浓度-时间图
[0026] 图7 :储存在温度为60°C、pH2. 3-4. 3条件下的浓度-时间图
[0027] 图8 :在pH3_8条件下的pH值-降解速率图
[0028] 图9 :在pH2. 3-4. 3条件下的pH值-降解速率图
[0029] 图10 :在pH2. 3-8条件下的pH值-降解速率图
[0030] 图11 :pH值-预期保质期T (90)图
[0031] 图12 :pH3-8、40°C条件下