一种基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米复合材料制备技术领域，特别涉及一种基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的设计及其制备方法。
技术背景
[0002]近年来，癌症等疾病越来越严重的威胁着人类的健康，而癌症早期很难被诊断发现从而延误最佳治疗期。关于癌症的早期诊断是一直困扰研宄者们的难题，如何将诊断与治疗结合起来，更有效的治疗癌症也一直是科学研宄者关注的焦点。在疾病诊断方面，超声波、磁共振成像(MRI)、CT、PET-CT等诊断技术是目前临床主要应用的手段。MRI由于其无损性和高分辨无伪影等特点被广泛应用临床诊断。利用光敏剂对癌症等疾病实行光动力学治疗(TOT)也具有一定的研宄基础，并且在不断发展和完善。但是把磁共振成像诊断和光动力学治疗两者结合起来，达到通过磁共振成像诊断精确定位肿瘤位置进而对该位置进行光动力学治疗，同时磁共振成像还可以对光动力学的疗效实时评估的目的。因此把两者结合起来达到诊断和治疗相结合是我们研宄的主要目标。但是如何把两者结合起来以及用于复合的载体的选择也是一个非常关键且难以解决的问题。
[0003]分子自组装化学近年来也有广泛的研宄:有机和无机分子通过自组装形成各种各样的结构。而这些分子自组装形成的特定结构是它们能够进行生物应用的先决条件。(J.F.Graveland-Bikker, C.G.de Kruif, Trends Food Sc1.Technol.2006, 17, 196-203.)
乳白蛋白是一种主要的乳清蛋白，可以被转化成能够诱导肿瘤细胞凋亡的蛋白质，同时还具有调节细胞溶解活性、产乳和诱导细胞生长抑制等多种功能，且其生物相容性优良。近期研宄发现丝氨酸蛋白酶作用下部分水解的α-乳白蛋白在一定条件下可以自组装形成细长且均一的、直径20nm左右的纳米管。(R.1psen, J.0tte, B1technol.Adv.2007, 25，602-605.)
[0004]因此发展新的合成方法，利用具有生物相容性的α_乳白蛋白不完全水解产物(多肽)作为载体，将磁共振成像造影剂和用于光动力学治疗的光敏剂复合，达到诊断与治疗协同作用同时又降低各试剂单独注入到体内时产生的生物毒性，具有重要的生物医学及临床意义。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是设计和制备一种基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球(BFNS)，该纳米复合球具有癌症等疾病的临床诊断及治疗作用。
[0006]本发明采用一步反应合成法，以α -乳白蛋白水解多肽为载体，在Ca2+和Gd3+共同诱导下自组装形成纳米球，在自组装的同时包覆了光敏剂孟加拉红。
[0007]本发明所述的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)将0.3-0.8mg由α -乳白蛋白水解得到的多肽固体溶于0.6_1.5mL浓度为70-80mM pH为5-9的三羟甲基氨基甲烷溶液中，振荡使其完全溶解；三羟甲基氨基甲烷溶液的pH值使用盐酸调节；
[0009](2)向步骤(I)的溶液中加入100-200 μ L浓度为0.5-1.5mM的孟加拉红溶液，混合摇匀；
[0010](3)将40-100 μ L浓度为5_15mM的可溶性Gd盐溶液，和10-50 μ L浓度为5-lOmM的可溶性Ca盐溶液加入步骤(2)的溶液中，然后在35-40°C下振荡培养反应20_30h ;
[0011](4)反应结束后，离心收集固体，即为基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球，最后将其分散在0.5-2mL水中。
[0012]所述的可溶性Gd盐为GdCl3;可溶性Ca盐为CaCl 2。
[0013]向0.5-2mL上述制备的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球分散液中加入0.5-1.5mg的1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.075-1.25mg的N-羟基琥珀酰亚胺，35-40°C培养5-20min后加入10-30 μ g的含RGD序列的多肽，继续35-400C °0培养反应2-10h ;离心收集固体，然后分散在浓度为0.01-0.02M的pH为7.3-7.6的PBS缓冲溶液中，即得到能够肿瘤靶向的双功能纳米复合球。
[0014]本发明采用α -乳白蛋白水解多肽作为载体将磁性造影剂Gd3+和光敏剂孟加拉红结合起来得到自组装的双功能纳米复合球，实现对疾病进行磁共振成像诊断和光动力学治疗的双重目标。该双功能纳米复合球表面可以修饰多肽RGD，得到具有靶向性的双功能纳米复合球，能被靶向输送到肿瘤位置。本发明合成的纳米复合球粒径在100-500nm范围内调控。参与诱导成球的Gd3+作为磁共振成像的造影剂单元，可有效提高T i加权核磁共振信号响应Cr1= 4.39s _1mM_1)，能够对肿瘤部位进行磁共振成像诊断。包覆于复合球的光敏剂孟加拉红在550nm激发光照下可释放单线态氧杀死癌细胞从而具有光动力学治疗效果，无光照时，纳米复合球没有毒性。同时治疗过程亦可以通过磁共振成像来进行示踪。另外该复合纳米球合成成本低廉，步骤简单，在生物医学领域具有潜在的广阔应用前景。
【附图说明】
[0015]图1:实施例1制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球溶液和孟加拉红(RB)溶液离心前后数码照片:左(a)为孟加拉红(RB)溶液离心前；左(b)双功能纳米复合球溶液离心前；右(a)为孟加拉红(RB)溶液离心后；右(b)双功能纳米复合球溶液离心后。
[0016]图2:实施例1制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的透射电镜图。
[0017]图3:实施例2制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的透射电镜图。
[0018]图4:实施例3制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的透射电镜图。
[0019]图5:红外光谱图:(a)孟加拉红(RB) ; (b)实施例1制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球；(C) α -乳白蛋白。
[0020]图6:实施例1制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的纵向弛豫率图。
[0021]图7:实施例1制得的基于金属离子诱导多肽自组装的双功能纳米复合球的光敏性效果图。
[0022]图8:实施例1制得的能够肿瘤靶向的双功能纳米复合球的暗毒性和光毒性实验图。
【具体实施方式】
[0023]实施例1
[0024](I)将0.5mg由α -乳白蛋白在丝氨酸蛋白酶作用下水解得到的多肽固体溶于ImL浓度为75mM pH为7.5的三羟甲基氨基甲烷溶液中，振荡使其完全溶解；三羟甲基氨基甲烷溶液的pH值使用盐酸调节；
[0025](2)向步骤(I)的溶液中加入120 μ L浓度为ImM的孟加拉红溶液，混合摇匀；
[0026](3)将100 μ L浓度为1mM的GdCl3溶液，和4