一种新型血小板冻干处理液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及血小板冻干干燥保存领域，具体涉及一种血小板冻干处理液。
【背景技术】
[0002] 血小板的冷冻干燥研宄开始于20世纪50年代，然而当时研宄结果并没有像人们 预期的那样成功。直到2001年，WolkersWF等再次对血小板进行了冻干保存的研宄，首次 使用海藻糖对血小板进行冻干前预处理，成功的冻干了血小板。前人对血小板冻干保存的 尝试预示着血小板冻干保存的可能性，冻干保存血小板成了研宄热点，国内亦有多家单位 对血小板进行了冻干研宄，但是目前已报道的冻干配方存在一些不足，如配方中蛋白质类 保护剂用人血清白蛋白，价格昂贵，且不易获取；也有用二甲基亚砜（dimethylsulfoxide， DMS0)预处理的，它有一定的毒性，且处理步骤繁琐等。目前依然没有一个公认的、稳定可靠 且经济的血小板冻干保存方法。
[0003] 还应该注意血小板冻干缓冲液渗透压和浓度问题，目前冻干血小板的研宄都很少 提到这一点。冻干缓冲液渗透压过高或过低都对血小板不利。冻干缓冲液浓度是决定冻干 成败及冻干产品质量的一个重要因素。冻干工艺要求冻干缓冲液重量浓度（w/v)在4%~ 25%之间为宜，最佳浓度在10%~15%。如果缓冲液浓度太高，干燥时药液表面首先干燥， 形成结构致密的表层，该表层孔隙细小，透气性差，因此下面的水气难以穿过干燥层，因而 沿瓶壁上升，导致制品离壁、萎缩；或使水气在干燥层停留时间过长，干燥的表层制品重新 吸潮，导致制品塌陷，体积缩小；另外，浓度太高时，药液在干燥过程中容易结块，所得制品 外观不均匀；缓冲液浓度过低时，所得制品结构比较疏松、机械强度低，在包装及运输过程 中受到振动易萎缩或变成粉末，影响制品的外观，甚至会导致溶质随水汽一起飞走，导致冻 干失败。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种血小板冻干处理液； 本发明的另一目的在于提供一种血小板冻干处理方法。
[0005] 本发明所采取的技术方案是： 一种血小板冻干处理液，由以下两部分组成： 1) 血小板冻干预处理液：由基础缓冲液加40~60mmol/L海藻糖和可逆性血小板激活 抑制剂，调节PH为6. 6~6. 8,过滤后制备得到； 2) 血小板冻干缓冲液：由基础缓冲液加40~60mmol/L海藻糖、可逆性血小板激活抑 制剂以及蛋白质类保护剂，调PH为6. 6~6. 8,过滤后制备得到。
[0006] 作为上述血小板冻干处理液的进一步改进，基础缓冲液的组成成分为：55mm〇l/ LNaCl, 2.lmmol/LKC1,0. 7mmol/LCaCl2,1.lmmol/LMgS04,31mmol/LNaHC03,3. 4mmol/L梓 檬酸，6. 7mmol/L梓檬酸钠，15mmol/L乙酸钠，10. 7mmol/L葡萄糖。
[0007] 作为上述血小板冻干处理液的进一步改进，海藻糖的浓度为50mmol/L。
[0008] 作为上述血小板冻干处理液的进一步改进，可逆性血小板激活抑制剂为0. 8~ L2ug/mLPGEl或 5mmol/LL-Arg0
[0009] 作为上述血小板冻干处理液的进一步改进，可逆性血小板激活抑制剂为lug/ mLPGElo 作为上述血小板冻干处理液的进一步改进，蛋白质类保护剂为2%v/v的BSA或30%v/v~40% v/v的血衆。
[0010] 作为上述血小板冻干处理液的进一步改进，蛋白质类保护剂为30%v/v的血衆。
[0011] 一种血小板冻干处理液，由以下两部分组成： (1) 血小板冻干预处理液：包括 55mmol/LNaCl，2.1mmol/LKCl，0.7mmol/LCaCl2， I.lmmol/LMgS04, 31mmol/LNaHC03, 3. 4mmol/L朽1 樣酸，6. 7mmol/L梓樣酸纳，15mmol/L乙 酸钠，10. 7mmol/L葡萄糖，50mmol/L海藻糖，lug/mLPGEl;调节pH为6. 6~6. 8,过滤后制 备得到； (2) 血小板冻干缓冲液：包括 55mmol/LNaCl，2.lmmol/LKCl，0.7mmol/LCaCl2， I.lmmol/LMgS04, 31mmol/LNaHC03, 3. 4mmol/L朽1 樣酸，6. 7mmol/L梓樣酸纳，15mmol/L乙 酸钠，10. 7mmol/L葡萄糖，50mmol/L海藻糖，lug/mLPGE1，30%血衆；调节pH为 6. 6 ~6. 8， 过滤后制备得到。
[0012] 一种血小板冻干处理方法，包括下列步骤： 1) 取血小板样品，离心弃上清液留沉淀，用与弃去上清同体积的血小板冻干预处理液 重悬血小板，37°C振荡水浴3h~6h，使血小板保持悬浮状态； 2) 水浴后，将血小板悬液再离心，弃上清液留沉淀，用与弃去上清同体积的血小板冻干 缓冲液重悬血小板； 3) 将预处理后的血小板悬液转移至冻干瓶中，于_80°C超低温预冻过夜，次日转入已 预冷的冻干机进行真空干燥，冷阱温度为_45±5°C，真空度为< 133mbar，真空干燥24h后 取出，将其密封后置于室温下保存； 其中所述血小板冻干预处理液及血小板冻干缓冲液如上所述。
[0013] 本发明的有益效果是： 本发明公开了 一种血小板冻干处理液及冻干处理方法，即用基础缓冲液加50mmol/L海藻糖和IUg/mlPGEl对血小板冻干前水浴负载海藻糖，再用基础缓冲液加50mmol/L海 藻糖、Iyg/mlPGEl和30%v/v~40%v/v血衆重悬血小板后冻干，制备得到了可在室温 下稳定保存的冻干血小板。
[0014] 本发明采用PGEl为可逆性血小板激活抑制剂，PGEl可有效抑制血小板聚集，降低 血栓素A2水平，还可抑制血小板活化，促进血栓周围已活化的血小板逆转；通过研宄发现PGEl对冻干后血小板回收率效果佳。
[0015] 白蛋白是一种常用的蛋白质类冻干保护剂，由于人血清白蛋白比较昂贵，而且很 难得，本发明优选2%v/v的BSA来代替人血清白蛋白制备得到冻干血小板，可满足各种外 部的使用需求。如果是在手术输液中的使用，考虑到BSA是牛血清蛋白，在人体中使用可能 会存在排异或者过敏反应的风险，本发明优选30%v/v~40%v/v血衆来代替人血清白蛋 白，并取得了很好的效果。血浆是很常见且较廉价的原料，而且含有白蛋白等蛋白质，用它 来代替昂贵的白蛋白作为血小板蛋白质类保护剂，经济实惠。
[0016] 本发明的血小板冻干处理液包括冻干预处理液和冻干缓冲液，其渗透压均为 311.6mOsm，与血浆渗透压（290~310m0sm)相近，不会对血小板产生不良影响。此外冻干 缓冲液重量浓度（w/v)约为29%;得到的冻干血小板外观尚可。
[0017] 将本发明的冻干血小板分别置于_20°C、4°C和室温下保存Od~180d，发现保存时 间相同的情况下，冻干血小板复水化后血小板回收率、MPV、血小板相对聚集率以及血小板 激活后释放的生长因子TOGF-BB、TGF- 0和VEGF差异均无显著性，即冻干血小板在三种温 度下保存效果相当。
[0018] 本发明的冻干血小板可以在室温下稳定保存至少6个月，为下一步制备血小板止 血药以及在手术中使用的血小板制品提供了便利和可能。
【附图说明】
[0019] 图1为透射电镜下血小板形态（40000X); 其中：a为冻干前血小板；b为复水化的冻干血小板。
【具体实施方式】
[0020] 英文缩略词如下： PGEl为前列腺素El，L-Arg为左旋