神经调节蛋白应用于人的安全剂量的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及对人体的安全给药剂量，特别地，涉及神经调节蛋白应用于人时的安 全剂量。
【背景技术】
[0002] 神经调节蛋白（neuregulin，NRG ;heregulin，HRG)，又叫神经胶质生长因子 (glial growth factor，GGF)、neu 分化因子（new differentiation factor，NDF)，为分子 量在44KD左右的糖蛋白，它们在细胞间传递信号，是酪氨酸激酶受体ErbB家族的配体。神 经调节蛋白家族含 4 个成员：NRGl，NRG2，NRG3，NRG^(Fallsetal.，ExpCellRes.284: 14-30, 2003)对后三者的生物学功能相对来讲知之甚少。NRGl在神经系统、心脏和乳腺中 起着重要作用，还有证据显示NRGl信号传递在其他一些器官系统的发育、功能以及人类疾 病（包括精神分裂症和乳腺癌）的发病机理中起作用。NRGl有很多异构体。对基因突变小 鼠（基因敲除小鼠）的研宄说明在N末端区或表皮生长因子（EGF)类似区不同的异构体， 其在体功能也不一样。本发明是以神经调节蛋白1β (NRGie)为基础的。
[0003] 神经调节蛋白 1β 为一跨膜蛋白（Holmes et al.，Science 256,1205-1210， 1992)。膜外部分是N末端，包括免疫球蛋白类似区（Ig-Iikedomain)和EGF类似区 (EGF-like domain)，膜内部分是C末端。在细胞外基质的金属蛋白酶作用下，神经调节蛋 白的膜外部分可被酶切下来而呈游离状态，从而有利于和周围细胞表面的ErbB受体结合， 激活相应的细胞信号传递。
[0004] ErbB受体家族也分为四类，ErbBl、ErbB2、ErbB3和ErbB4,它们都是跨膜蛋白，分 子量在180-185KD附近。除ErbB2外，它们在膜外的N末端都含配体结合区；除ErbB3外， 它们在膜内的C末端都含蛋白酪氨酸激酶活性。其中ErbBl是表皮生长因子的受体，ErbB3 和ErbB4都是神经调节蛋白的受体。在神经调节蛋白的受体中，只有ErbB2和ErbB4在心 脏表达量较高。（Yarden et al·，Nat Rev Mol Cell Biol，2:127-137,2001)
[0005] 当神经调节蛋白与ErbB3或ErbB4的膜外部分结合时，将引起ErbB3、ErbB4与其 他ErbB受体（常常包括ErbB2)形成异源二聚体，或ErbB4自身形成同源二聚体，然后导致 受体的膜内部分被磷酸化（Yarden et al.，Nat Rev Mol Cell Biol，2:127-137,2001)。磷 酸化的膜内部分可进一步与细胞内的多种信号传递蛋白结合，从而激活下游ERK或AKT信 号通路，引起一系列细胞反应：包括刺激或抑制细胞增殖、细胞凋亡、细胞迀移、细胞分化或 细胞粘连。
[0006] 神经调节蛋白对心脏的发育尤其重要（W00037095, CN1276381，W003099300， W09426298, US 6444642, WO 9918976, WO 0064400, Zhao et al. , J. Biol. Chem. 273, 10261-10269,1998)。在胚胎发育早期，神经调节蛋白的表达主要局限于心内膜，随后通过 旁分泌途径释放到周围心肌细胞并与细胞膜上的蛋白酪氨酸激酶受体ErbB4膜外部分结 合，ErbB4进而与ErbB2形成异源二聚体。ErbB4/ErbB2复合物的形成及激活对早期海绵样 心脏形成小梁是必须的。神经调节蛋白、ErbB4和ErbB2三个蛋白基因中的任何一个缺失 都会使胚胎没有小梁并在发育早期死于子宫。W00037095显示一定浓度的神经调节蛋白可 持续激活ERK信号通路，促进心肌细胞的生长及分化，引导心肌细胞和细胞粘连处肌节和 细胞骨架的重建，改善心肌细胞的结构，增强心肌细胞的收缩。W00037095及W003099300还 指出神经调节蛋白可用于检测、诊断和治疗各种心血管疾病。
[0007] 下面列举了与本发明有关的一些现有技术文献：
[0008] 1、Cardiac muscle function and manipulation，W00037095
[0009] 2、生长因子神经调节蛋白及其类似物的新应用，CN1276381
[0010] 3、Neuregulin based methods and compositions for treating cardiovascular diseases，W003099300
[0011] 4、You-yang Zhao, Douglas R. Sawyer，Ragavendra R. Baliga，Douglas J. Opel? Xinqiang Han，Mark A. Marchionni，and Ralph A. Neuregulins Promote Survival and Growth of Cardiac Myocytes. Kelly J. Biol.Chem. 273,10261-10269(1998)
[0012] 5、Methods for treating muscle diseases and disorders，W09426298
[0013] 6、Methods of increasing myotube formation or survival or muscle cell mitogenesis，differentiation or survival using a neuregulin，US 6444642
[0014] 7、Therapeutic methods comprising use of a neuregulin，WO 9918976
[0015] 8、Methods for treating congestive heart failure，WO 0064400
[0016] 9、William E. Holmes，Mark X. Sliwkowski，Robert W. Akita，William J. Henzel， James Lee，John W. Park，Daniel Yansura，Nasrin Abadi，Helga Raab，Gail D.Lewis， H. Michael Shepard，Wun-Jing Kuang，William I. Wood，David V. Goeddel，Richard L. Wandlen. Identification of heregulin，a specific activator of pl85 (erbB2). Science 256,1205-1210(1992)
[0017] 10、Douglas L. Falls.Neuregulins :functions，forms，and signaling strategies. Experimental Cell Research 284?14-30 (2003)
[0018] 11、 Yosef Yarden， Mark X.Sliwkowski.Untangling the ErbB signalling Network. Nature Reviews :Molecular Cell Biology 2127-137(2001)。
[0019] 我们已经发现给心衰大鼠连续数次注射一定量（149. 3U/kg :蛋白量/体重）的神 经调节蛋白能激活其体内的ERK和AKT信号通路，并有利于心力衰竭的恢复。
[0020] 为了找到用神经调节蛋白治疗人心脏病的有效、安全剂量，需要先对健康人做毒 理实验，找到对健康人无毒负作用的安全剂量。本发明通过大量实验和分析，发现了神经调 节蛋白应用于人的安全剂量，满足了此种需要。
[0021] 发明概述
[0022] 本发明提供了神经调节蛋白应用于人时的安全剂量。在本发明的一种实施方案 中，所述的安全剂量是将神经调节蛋白一次或多次施用给健康人群时，所获得的健康人体 能承受的安全剂量。具体地，所述安全剂量在大约2. 99至大约35. 83U/kg (蛋白/体重）的 范围内，例如大约 2. 99U/kg、大约 5. 97U/kg、大约 11. 94U/kg、大约 17. 92U/kg、大约 23. 89U/ kg或大约35. 83U/kg(蛋白/体重）。更优选地，所述的安全剂量是在大约2. 99至大约 17. 92U/kg(蛋白/体重）的范围内，例如大约2. 99U/kg、大约5. 97U/kg、大约11. 94U/kg或 大约17.92U/kg(蛋白/体重）。
[0023] 本发明还提供了对人体安全使用神经调节蛋白剂量的方法，其包括将一定剂量的 神经调节蛋白一次或多次施用给健康人群，而不会引起负反应或者只引起可以被接受程度 的负反应。其中，所述的剂量在大约2. 99至大约35. 83U/kg(蛋白/体重）的范围内，例 如大约 2. 99U/kg、大约 5. 97U/kg、大约 11. 94U/kg、大约 17. 92U/kg、大约 23. 89/kg 或大约 35. 83U/kg (蛋白/体重）。更优选地，所述的剂量是在大约2. 99至大约17. 92U/kg (蛋白/ 体重）的范围内，例如大约2. 99U/kg、大约5. 97U/kg、大约11. 94U/kg或大约17. 92U/kg (蛋 白/体重）。在优选的实施方案中，将在大约2. 99至大约17. 92U/kg(蛋白/体重）范围内 例如大约2. 99U/kg、大约5. 97U/kg、大约11. 94U/kg或大约17. 92U/kg(蛋白/体重）的神 经调节蛋白一次或多次施用给健康人群，而不会引起负反应或者只引起可以被接受程度的 负反应。或者，将超过17. 92U/kg至大约35. 83U/kg (蛋白/体重）范围内例如大约23. 89/ kg或大约35. 83U/kg(蛋白/体重）的神经调节蛋白一次施用给健康人群，而不会引起负反 应或者只引起可以被接受程度的负反应。
[0024] 本发明还提供了对于人体为安全的药物制剂，其中包含安全剂量的神经调节蛋 白。所述安全剂量在大约2. 99至大约35. 83U/kg (蛋白/体重）的范围内，例如大约2. 99U/ kg、大约 5. 97U/kg、大约 IL 94U/kg、大约 17. 92U/kg、大约 23. 89/kg 或大约 35. 83U/kg (蛋 白/体重）。更优选地，所述安全剂量是在大约2. 99至大约17. 92U/kg (蛋白/体重）的 范围内，例如大约2. 99U/kg、大约5. 97U/kg、大约11.94U/kg或大约17. 92U/kg(蛋白/体 重）。
[0025] 附图简述
[0026] 图1是受试者A302(35. 83U神经调节蛋白/kg体重）在给药前的心电图。
[0027] 图2是受试者A302 (35. 83U神经调节蛋白/kg体重）在给药后2小时的心电图。
[0028] 图3是受试者A302 (35. 83U神经调节蛋白/kg体重）在给药后24小时的心电图。
[0029] 图4是受试者A302 (35. 83U神经调节蛋白/kg体重）在给药7天后的心电图。
[0030] 图5是给药17.92U/kg(神经调节蛋白/体重）组受试者C405在给药前的心电图。
[0031] 图6是给药17.92U/kg(神经调节蛋白/体重）组受试者C405在第一次给药后24 小时的心电图。
[0032] 图7是给药17. 92U μ g/kg(神经调节蛋白/体重）组受试者C405在第二次给药 后2小时的心电图。
[0033] 图8是给药17. 92U/