N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种负载新城疫弱毒活疫苗的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒的制备方法。
【背景技术】
[0002]新城疫(NewcastleDisease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle DiseaseVirus, NDV)引起的一种高度接触性传染病，NDV对黏膜有特殊的亲嗜性，特别是对呼吸道和消化道黏膜，黏膜成为抗NDV感染的第一道防线。因此，提高黏膜免疫系统的防御能力，可有效阻止NDV的吸附和侵入。目前，ND的预防接种常用的疫苗是传统的弱毒活疫苗和灭活疫苗，但二者在实际应用中均具有一定的局限性，如何提高疫苗的免疫效果是疫苗免疫研宄中迫切需要攻克的课题，疫苗剂型和递送方式的改造是提高疫苗免疫效果的方法之一。目前，正在发展的纳米粒黏膜免疫递送系统是解决上述问题的最有希望的途径之一。由于壳聚糖分子间存在强烈的氢键作用，具有高结晶度，使得壳聚糖化学性质十分稳定，只能溶于稀酸，几乎不溶于水和有机溶剂，这种特性使壳聚糖既难以形成纳米粒子，也不利于在碱性肠道环境中的吸收，在很大程度上限制了其广泛应用。因此，在制备理想的壳聚糖纳米载药粒子设计中，如何解决壳聚糖的水溶性成为了能否将其更大程度的用作纳米载药粒子基质物质的关键。
【发明内容】
[0003]本发明是要解决由于壳聚糖的溶解性差、取代度低，导致壳聚糖纳米粒对疫苗抗原的包封率和载药量低，在黏膜表面吸附能力差的问题，提供一种N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备方法。
[0004]本发明N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备方法，按以下步骤进行:
[0005]一、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖(N-2-HFCC)的制备；
[0006]二、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)的制备:
[0007]a、取0.5?2.0mg/mLN-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖溶液5mL，向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min混合均匀，得溶液A ;
[0008]b、将溶液A在室温、无菌条件下，以900?1400r/min磁力搅拌10?50min后，向其中匀速滴加0.5?3.0mg/mL N, O-羧甲基壳聚糖溶液1.25?7.5mL，得溶液B ；
[0009]C、将溶液B于4°C、12000r/min离心20min，沉淀经去离子水洗三次，真空冷冻干燥24h，即得负载新城疫弱毒活疫苗的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)。
[0010]步骤二 a中新城疫L-系病毒液的病毒含量为107 5EID5Q。
[0011]本发明是利用环氧氯丙烷与N，N-二甲基乙胺发生开环反应，得到环氧丙基二甲基乙基氯化,安(Epoxy propyl two methyl ethyl ammonium chloride，EEA)，在把EEA接枝到壳聚糖(CS)的氨基上，形成N-2-轻丙基二甲基乙基氯化钱壳聚糖(N-2-hydroxypropylmethyl ethyl ammonium chloride chitosan，N-2-HFCC);之后，再将 N-2-HFCC 与羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)聚合形成N_2_轻丙基二甲基乙基氯化钱壳聚糖/羧甲基壳聚糖纳米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)。该发明采取新城疫病毒(L系)作为模型药物。
[0012]与壳聚糖纳米粒子相比，本发明制备的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs粒径容易控制，NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs 粒径在 120_500nm 之间，NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPsZeta电位在60_30mV之间，最大包封率可达96.6%。
[0013]本发明的创新点是将自制环氧丙基二甲基乙基氯化铵成功接枝到壳聚糖上得到N-2-HFCC，使壳聚糖具有较好的水溶性。壳聚糖分子间与分子内含有大量氢键，由于环氧丙基二甲基乙基氯化铵的引入，使壳聚糖分子间与分子内的氢键被破坏，且水分子更容易接近这种松散的无定形状态的大分子，改性后的壳聚糖衍生物中含有的亲水基团环氧丙基二甲基乙基氯化铵，可以与水分子再次形成氢键，因而溶解度增加，成功的提高了壳聚糖的水溶性。并将所得材料N-2-HFCC制备成载新城疫纳米粒NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs，本方法制备的纳米粒生物安全性高，抑菌效果好，包封率高，并且降低了壳聚糖的分子量，使得药物更好地与小肠壁细胞结合，更容易被肌体吸收。
【附图说明】
[0014]图1为壳聚糖和环氧丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的傅立叶转换红外谱图。
[0015]图2为环氧丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的核磁谱图。
[0016]图3为壳聚糖和环氧丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的XRD谱图。
[0017]图4为应用牛津杯发对环氧丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖所做的抑菌实验图。
[0018]图5为环氧丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖取代度测定。
[0019]图6为实施例1制备的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs的体外释放曲线图。
[0020]图7为实施例1制备的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs的透射电镜图。
[0021]图8 为实施例1 制备的 NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs 的 Zeta 电位图。
[0022]图9为实施例1制备的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs的粒径分布图。
【具体实施方式】
[0023]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0024]【具体实施方式】一:本实施方式N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒的制备方法，按以下步骤进行:
[0025]一、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖(N-2-HFCC)的制备；
[0026]二、N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/羧甲基壳聚糖新城疫病毒纳米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)的制备:
[0027]a、取0.5?2.0mg/mLN-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖溶液5mL，向其中滴加2mL新城疫L-系病毒液，磁力搅拌3min混合均匀，得溶液A ;
[0028]b、将溶液A在室温、无菌条件下，以900?1400r/min磁力搅拌10?50min后，向其中匀速滴加0.5?3.0mg/mLN, O-羧甲基壳聚糖溶液1.25?7.5mL，得溶液B ；
[0029]C、将溶液B于4°C、12000r/min离心20min，沉淀经去离子水洗三次，真空冷冻干燥24h，即得负载新城疫弱毒活疫苗的N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖/N，O-羧甲基壳聚糖纳米粒(NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs)。
[0030]本发明在壳聚糖的-NH2上引入环氧丙基二甲基乙基氯化铵，获得N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖，N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖与壳聚糖仅在酸性pH条件下具有水溶性相比，N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖在更宽pH范围内具有了良好的水溶性；同时，使得N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖纳米粒对疫苗抗原的包封率和载药量大大提高；此外，N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖能更好的附着在机体呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等黏膜表面，具有更好的促吸收作用，诱导黏膜免疫反应。本发明解决了现有的壳聚糖溶解性差、取代度低、包封率和载药量低、黏膜表面吸附能力差的问题，进一步拓宽了壳聚糖的应用范围。
[0031]本实施方式以N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖(N-2-HFCC)为载体，新城疫病毒La Sota株为模型药物，采用聚电解质复合法制备NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs，通过单因素试验和正交试验设计筛选具有外形圆整、表面光滑、粒径大小适宜、粒径分布小、包封率高、稳定性好和适宜释放速率的NDV/LaSota-N-2-HFCC/CMC-NPs制备工艺条件，所制备的疫苗能提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平，使这些免疫鸡群具有更强的抗病毒能力，在受到强毒攻击时，表现出更佳的免疫保护效果。本实验简便易操作，制备过程中所需溶剂均为常用试剂，容易获得，成本低，后续处理也较为简单。
[0032]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一不同的是:步骤一中N-2-羟丙基二甲基乙基氯化铵壳聚糖的制备方法如下:
[0033]一、环氧丙基二甲基乙基氯化铵(EEA)的合成:
[0034]向4?15°C装有电动搅拌器、滴液漏斗和冷凝回流装置的干燥三口烧瓶中加入环氧氯丙烷，不断搅拌并滴加N，N- 二甲基乙胺，Ih内加完，同时加热至10?35°C，恒温反应4?14h后，停止反应，产品用冰丙酮洗涤，抽滤，将抽滤后的产品置于表面皿中，放真空干燥器中干燥6?24h，得到环氧丙基二甲基乙基氯化铵；其中环氧氯丙烷与N，