氢气给予大鼠；第三组为对照组，即不采取任何治疗措施。
[0031] 首先，建立大鼠神经胶质瘤模型，方法如下：
[0032] 大鼠神经胶质瘤细胞C6的准备：新复苏C6细胞，接种前再传代1次，24小时后更 换1次培养基，在细胞对数生长期时，以〇. 25%胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液， Hanks液洗涤2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为IX106/10y1，置于37°C水浴中待接 种。苔盘蓝排斥实验检测细胞活力>95%。
[0033] 06细胞脑内原位接种：接种当天，3.5%水合氯醛于大鼠腹腔内注射（11111/10(^) 麻醉后，将大鼠头部用立体定向架固定。在头顶双侧眼裂连线后大约1.5cm处纵向切开头 皮，暴露前囱颜骨标志，前囱中点后1_，矢状缝右侧旁开3mm处用牙科钻钻孔，孔径1. 0_， 50y1微量注射器抽取IX10710y1细胞悬液，经骨孔处缓慢进针至硬脑膜下6mm，后退 1_，于IOmin内将细胞悬液注完（Iy1/min)，注射完毕后留针5min，缓慢退针，骨赌封闭骨 孔，1号丝线缝合头皮切口，对接种的大鼠进行单笼饲养。
[0034] 大鼠接种后的给药处理：富氢生理盐水组大鼠每天早上9点和晚上5点分两次给 药处理，氢气组按照上述方法给药处理，对照组常规饲养。给药两周后将大鼠处死，打开头 颅将神经胶质瘤小心取出并测量肿瘤体积（应用公式（a2Xb)/2计算，其中a为肿瘤短径， b为肿瘤长径）。
[0035] 结果如图1所示，与对照组相比，富氢生理盐水组和氢气组的神经胶质瘤体积明 显缩小，说明这两种治疗方法对神经胶质瘤均有很好的抑制作用。
[0036] 实施例2:富氢细朐培养液可以抑制大鼠神经胶质瘤细朐C6的牛长、浸润和讦務
[0037] C6细胞分为两组，第一组为氢处理组，即用富氢细胞培养液进行细胞培养；第二 组为对照组，即用普通培养液进行细胞培养。细胞培养24h后进行体外实验检测细胞功能 的改变。
[0038] MTT法检测细胞生长：将上述两组细胞用0. 25 %的胰蛋白酶消化后，以 2X103cells/100y1/well的细胞密度接种C6细胞于96孔板中，每组接种6孔。以接种后 第1、2、3、4、5天为5个观察时间点，共铺5块板，于37°C，5%CO2孵箱中培养。细胞培养 24h后取出其中一块板，每孔加入5mg/ml的MTT10y1，于37°C，5 %CO2孵箱中培养4小时。 小心吸弃培养上清液，每孔加入100UIDMSO,并震荡IOmin使MTT充分溶解。用酶标仪测 定波长570nm处各孔的吸光值（OD值）。以后每24小时取出一块板按照上述步骤进行。最 后以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图2所示，与对照组相比， 氢处理组C6细胞的生长速率明显降低。
[0039]Transwell法检测细胞浸润：将Matrigel溶于无血清细胞培养液中，终浓度为 0? 5mg/ml，将其加到24孔板的insert中，55°C干燥3小时后用100y1去离子水水化40min 备用。将上述两组细胞用0. 25%的胰蛋白酶消化后，按照2X104cells/200yl/well的密 度将细胞接种于24孔板的insert中，每组接种3孔。经细胞培养72小时，并用结晶紫染 色后计数穿过膜的细胞数。结果如图3所示，与对照组相比，氢处理组的穿膜细胞数明显减 少，说明氢处理对C6细胞的浸润能力具有明显的抑制作用。
[0040] 划痕实验检测细胞迀移：将上述两组细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，按照 2X105cells/500y1/well的密度将细胞接种于24孔板中，每组接种3孔。于37°C，5%CO2 孵箱中培养24小时。待细胞融合后，用无菌的IOyl枪头在well底中央划垂直的"一"字 线，宽度约200ym。用细胞培养液冲洗若干次，以洗去划痕处的细胞，再换上新鲜培养液 于37°C，5%CO2孵箱中培养。倒置显微镜下观察，分别记录0、6、24小时的划痕创面愈合情 况。细胞迀移能力以迀移率表示，细胞迀移率（％) =(原划痕宽度-现划痕宽度）/原划 痕宽度X100%。结果如图4和表1所示，与对照组相比，氢处理组的细胞迀移率明显降低， 说明氢处理对C6细胞的迀移能力具有明显的抑制作用。
[0041] 表1氢处理对C6细胞迀移能力的影响
【主权项】
1. 一种至少包含氢分子的液体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述至少包含氢分子的液体的溶剂纯水、去 离子水、蒸馏水、生理盐水或有机酸的酸性水溶液。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的液体包含0.Ippm以上即 0. 05mM以上的氢分子。
4. 如权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在至少包含氢分子的液体还包含氧分 子。
5. 如权利要求1-4任意一项中所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的液体通过口 月艮、注射或洗浴的方式施用。
6. -种含有至少包含氢分子的气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用。
7. 如权利要求6中所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的气体是氢气和氧气的气 体混合物或者是氢气、氧气和惰性气体的气体混合物。
8. 如权利要求6中所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的气体是氢气和空气的气 体混合物。
9. 如权利要求6-8中任何一项所述的应用，其特征在于至少包含氢分子的气体包含体 积浓度为1. 〇% -4. 5 %的氢气。
10. 如权利要求1-9中任何一项所述的应用，其特征在于所制备抗神经胶质瘤的药物 用于抑制神经胶质瘤细胞的生长、或者抑制神经胶质瘤细胞的浸润、或者抑制神经胶质瘤 细胞的迀移。
【专利摘要】本发明涉及至少包含氢分子的液体/气体在制备抗神经胶质瘤的药物中的应用，从而提高药物的抗神经胶质瘤效果。通过本发明所制备的抗神经胶质瘤的药含有至少包含氢分子的液体或气体。在该介质中既可以包含气体分子，如氧分子、二氧化碳分子等，还可以包含液体，如纯水、去离子水、蒸馏水、生理盐水、有机酸的酸性水溶液等。所制备的抗神经胶质瘤的药具有抑制神经胶质瘤细胞生长、浸润和迁移的作用。
【IPC分类】A61K33-00, A61P35-00
【公开号】CN104800238
【申请号】CN201510174156
【发明人】谢飞, 马雪梅, 刘梦昱, 李佳腊, 赵鹏翔
【申请人】北京工业大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月13日