一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种负责组织再生和修复的成体干细胞，最初发现于骨髓中，由于其再生和免疫调节的潜能，已在各大领域引起广泛的关注。人类脐带间充质干细胞，尤其是来源于Wharton’s jelly (脐带中包绕两条脐动脉和一条脐静脉黏蛋白样结缔组织)被认为是细胞治疗和再生医学中理想的种子细胞。脐带是一种胚胎外组织，因此脐带间充质干细胞具备胚胎干细胞和成体干细胞的双重特性，其自我更新及多向分化潜能明显优于骨髓间充质干细胞。
[0003]有越来越多的证据表明，活性氧(ROS)对细胞增殖、分化、死亡、基质环境的稳态、氧化还原信号机制等是必不可少的，但细胞异常水平的ROS会导致DNA、蛋白质、脂类不可逆转的损害，最终细胞走向衰老和死亡的命运。
[0004]尽管MSCs在再生医学中的应用得到广泛关注，但其在体外扩增和体内移植过程中却不可避免的暴露于相当大的氧化应激之下，造成ROS (如过氧化氢、羟基自由基、超氧化物阴离子自由基)超标。体外长期培养的MSCs内H2O2水平增加，导致细胞衰老和增殖抑制。骨性关节炎和类风湿关节炎患者体内软骨细胞或中性粒细胞和巨噬细胞产生异常水平的ROS，影响MSCs的再生潜力。研宄表明，ROS的累积是由于接触炎症细胞因子引起，从而抑制干细胞的细胞增殖和多向分化潜能。
[0005]ROS生成和消除之间的平衡对细胞生存、增殖、分化至关重要。超氧化物歧化酶(SOD)，包括含有铜、锌(S0D1和S0D2)和锰(S0D2)的同功酶，保护MSCs免受超氧化物阴离子催化生成的H2O2的活性氧损害。氧化应激可以消除S0D2引起的人类滑膜起源的间充质干细胞的软骨分化能力下降和基质金属蛋白酶的表达增加。此外，SOD产生的H2O2被过氧化氢酶(catalase)所中和，先前的大量研宄表明，提高MSCs内的catalase活性有利于缓解H2O2诱导的细胞凋亡。
[0006]MSC起源的细胞外基质(ECM)组分包含I型和III型胶原蛋白，纤连蛋白、层粘连蛋白，可以充当体外培养系统的微环境，促进MSC扩增、指引MSC向特定方向分化。脱细胞的ECM不仅可以模拟体内干细胞细胞外微环境，还可调节生长因子和激素的生物学行为。这种运用脱细胞的ECM的培养方法可防止细胞复制衰老，增强终末分化细胞的再分化能力，如软骨细胞和髓核细胞。最近的研宄表明，脱细胞的ECM能改善骨髓间充质干细胞抵抗H2O2诱导的氧化应激和细胞周期停滞。然而，ECM对脐带间充质干细胞内抗氧化系统的影响却鲜有人知。
【发明内容】
[0007]解决的技术问题:针对现有的MSCs在体外扩增和体内移植过程中不可避免的暴露于相当大的氧化应激之下，造成ROS超标的缺点，本发明提供一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用，通过脐带间充质干细胞分泌基质制备细胞外基质生物材料，不仅具有多种蛋白质成分的特征，而且能用于间充质干细胞的体外扩增，具有生物相容性好、增殖效率高、显著降低细胞内活性氧含量的优点。
[0008]技术方案:
本发明的检测内容包括:(I)细胞外基质生物材料对UC-MSCs增殖能力的影响；(2)细胞外基质生物材料对UC-MSCs内ROS和H2O2表达的影响；(3)细胞外基质生物材料对UC-MSCs内S0D-2表达的影响；(4)细胞外基质生物材料对UC-MSCs内Catalase活性的影响。
[0009]上述所述的内容通过以下步骤实现:
(A)脐带间充质干细胞(umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)培养在完全培养基中(完全培养基组分为a-MEM和胎牛血清，它们的体积比为(4-9): 1，并且含有抗生素，抗生素的含量为10~200 U/mL)，密度多90%时，加入含有抗坏血酸(100-200uM)的完全培养液培养7-10天，每3天换液一次，之后加入脱细胞液(由pH值为7.4的磷酸盐缓冲液配制，含有Triton X-100 0.5-5%体积比和氨水10_40mM)，构建成细胞外基质生物材料；
(B)UC-MSCs分别培养在普通的孔板(TCPS板)和底部铺有细胞外基质生物材料的孔板(ECM板)中，在不同的时间点检测孔板中DNA含量，二乙酸荧光素(FDA)染色记录不同时间点的细胞数量及形态变化；
(C)检测TCPS板和ECM板上UC-MSCs内ROS和H2O2含量；
(D)检测TCPS板和ECM板上UC-MSCs内S0D-2含量和Catalase活性。
[0010]所述UC-MSCs取自人源、猪源、鼠源或兔源。
[0011]所述细胞外基质生物材料可应用于包括细胞移植治疗和再生医学等领域。
[0012]上述所述的内容具体分析步骤如下:
(I)FDA染色、DNA定量检测分析细胞外基质生物材料对UC-MSCs增殖能力的影响。
[0013](2) DCF-DA荧光定量法检测细胞内ROS水平。
[0014](3) H2O2检测试剂盒检测细胞内H 202水平。
[0015](4) Western bort 检测细胞内 S0D-2 含量。
[0016](5) Catalase活性检测试剂盒检测细胞内Catalase活性水平。
[0017]H2O2是ROS主要成分之一，在细胞增殖中起着双重作用。低水平的H2O2 (〈10 μΜ)刺激成纤维细胞生长，而细胞暴露于高浓度的H2O2 (>400 μ Μ)则会快速凋亡。本发明的方案表明，细胞外基质生物材料培养细胞的细胞内H2O2水平下降，是支持细胞体外生存和快速增殖的一个重要原因。此外，超氧化物阴离子以剂量依赖的方式影响细胞增殖，低水平的超氧化物阴离子刺激细胞增殖，浓度增加则会抑制细胞生长。
[0018]增强抗氧化能力引起UC-MSCs中ROS水平下降，临床治疗方面有着广泛的应用。骨性关节炎中软骨细胞的S0D-2活性受损不仅导致其氧化损伤，还能加快骨性关节炎的发病进程。
[0019]MSCs广泛应用于细胞移植治疗和组织工程的研发，然而病理条件下超标的ROS产生的炎症细胞因子改变了 MSCs的某些特性，影响其生存。因此在体内移植的过程中，防止细胞氧化应激损伤和提高细胞存活率显得尤为重要。先前的研宄证明细胞培养在源自滑膜细胞或骨髓细胞的脱细胞ECM显著降低ROS水平，这样阐明ECM调控细胞内抗氧化防御的潜在分子机制将变得很有意义。
[0020]有益效果:本发明提供的一种增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能的细胞外基质生物材料、制备方法及其应用，MSCs在该细胞外基质生物材料中培养比在TCPS板上培养的细胞内抗氧化活性的酶表达水平更高，尤其是S0D-2和Catalase ;S0D_2和Catalase活性增强导致ROS和H2O2水平减少，因此细胞外基质生物材料能够增强体外培养间充质干细胞生物抗氧化功能。
【附图说明】
[0021 ] 图1为FDA染色记录不同时间点TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情况图。
[0022]图2为DNA定量检测分析不同时间点TCPS板和ECM板上UC-MSCs的增殖情况图。
[0023]图3为TCPS板和ECM板上UC-MSCs内ROS和H2O2含量变化图。
[0024]图4为TCPS板和ECM板上UC-MSCs内S0D-2含量变化图。
[0025]图5为TCPS板和ECM板上UC-MSCs内Catalase活性变化图。
[0026]
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0028]实施例1
具体实验步骤如下: