针对活化蛋白C (aPC)的单克隆抗体的制作方法
【专利说明】针对活化蛋白C(aPC)的单克隆抗体
[0001] 本申请要求2012年11月29日提交的美国临时专利申请号61/731，294和2013 年3月15日提交的美国临时专利申请号61/786, 472的优先权，它们的公开内容因此以其 整体作为参考并入本文。 序列表提交 与本申请相关的序列表以电子形式通过EFS-Web提交，并因此以其整体作为参考并入 说明书。
[0002] 实施方式领域 提供了分离的单克隆抗体和其片段，其优先结合人蛋白C的活化形式（aPC)。
[0003] 背景 人蛋白C (PC)酶原在肝中作为461个氨基酸残基前体合成并分泌到血液中（如SEQ ID NO: 1中所示）。在分泌之前，单链多肽前体通过除去二肽（Lysl56-Argl57)和42个 氨基酸残基前原前导序列（preproleader)转化成异二聚体。异二聚体形式（417个残基） 由通过二硫桥连接的轻链（155aa，21 kDa)和重链（262aa，41 kDa)组成（如SEQ ID NO: 2中所示）。PC酶原包含凝血酶切割位点，导致"活化肽"的去除和PC活化成活化的 PC (aPC)形式（405个残基），其显示于SEQ ID NO: 3中。图1提供人PC及其活化形式 aPC的卡通描绘。人PC包含9个Gla-残基和4个用于N-联糖基化的潜在的位点。轻链 包含Gla结构域和2个EGF-样结构域。重链带有活性丝氨酸蛋白酶结构域。
[0004] PC通常以3_5ug/ml (~65nM)在健康人血液中循环且其半衰期为6-8小时。循环 型PC酶原的主要形式是异二聚体形式。PC的轻链含有一个富含Y-羧基谷氨酸（Gla)的 结构域（45aa)、两个EGF样结构域（46aa)和接头序列。PC的重链带有12-aa的高度极性 "活化肽"以及具有典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体的催化结构域。
[0005] 人PC经历广泛的翻译后修饰，包括糖基化，维生素K依赖性Y _羧基化和丫 _羟 基化（1-2)。它含有23%的碳水化合物（以重量计)和4个潜在的N-联糖基化位点(一个在 轻链Asn97和三个在重链Asn248/313/329)。 其Gla结构域含有9个Gla残基并负责PC 钙依赖性结合至带负电磷脂膜。Gla结构域也可结合内皮蛋白C受体（EPCR)，其在PC活 化期间与内皮膜上的凝血酶以及凝血调节蛋白密切合作。
[0006] 蛋白C酶原通常转化为它的活性酶-活化蛋白C(aPC)以具有生物效力。PC途 径的活性是由PC活化以及aPC失活的比率所控制。PC活化以两步骤过程发生在内皮细胞 表面上。其需要PC结合（经由Gla结构域）至内皮细胞上的EPCR，然后是PC通过凝血酶 /凝血调节蛋白复合物的蛋白水解活化。由内皮细胞表面上的凝血酶/凝血调节蛋白催化 的在人PC重链Argl2处的单一切割释放12-aa的AP并且将酶原PC转化成活性丝氨酸蛋 白酶aPC。因此，PC和的aPC的氨基酸序列之间的主要区别是PC中存在12-aa活化肽，而 在APC中不存在。PC活化成aPC也诱导构象变化；因此只有aPC而不是PC可在其酶活性 位点中被苯甲脒或以氯甲基酮（CMK)肽抑制剂标记。近来已解析无Gla-结构域aPC在与 CMK-抑制剂的复合物中的晶体结构。人血浆中的主要aPC灭活剂为以IOOnM存在于人血浆 中的蛋白C抑制剂（PCI)，其为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白超家族的成员。在生理条件下，aPC 以极低浓度（l-2ng/ml或40pM)循环于人血液中，半衰期为20-30min。
[0007] 蛋白C途径充当对抗血栓的天然防御机制。其不同于其它抗凝剂，因为它是一种 按需系统（〇n-demand system)，当凝血反应增强时其能够放大抗凝反应。在受伤之后，产生 凝血酶用于凝血。同时，凝血酶也通过结合至排列在血管表面上的凝血调节蛋白而触发抗 凝反应，这促使蛋白C活化。因此，aPC生成大体上与凝血酶浓度以及PC水平成比例。
[0008] 蛋白C途径作为凝血过程的主要调解者的生理学重要性通过三个临床发现显 示：（a)与蛋白C缺乏相关的严重血栓并发症以及通过蛋白C补充纠正该缺陷的能力； (b)与蛋白C辅因子（蛋白S)缺乏相关的家族性血栓形成倾向；以及（c)与在其底物 (因子V Leidei R506Q)中的遗传性突变有关的血栓风险，使其对于被aPC切割具有抗性 (Bernard, GR et.al. N Engl J Med 2001,344:699-709 综述）〇
[0009] 相对于其它维生素K依赖性凝血因子，aPC作为抗凝剂通过两种凝血辅因子-因 子Va以及VIIIa的蛋白水解失活来发挥作用，从而抑制凝血酶生成。作为降低的凝血酶水 平的结果，由凝血酶诱导的炎症、促凝血以及抗纤维蛋白溶解反应降低。aPC也通过与纤溶 酶原活化因子抑制剂（PAI)形成复合物而直接促成增强的纤维蛋白溶解反应。
[0010] 除了其抗凝功能以外，aPC也引起细胞保护效应，包括抗炎症以及抗凋亡活性，以 及内皮屏障功能的保护。aPC对细胞的这些直接细胞保护效应需要EPCR以及G蛋白偶联受 体，蛋白酶活化受体-l(PAR-l)。因此，aPC促进纤维蛋白溶解作用并抑制血栓与炎症。aPC 的抗凝以及细胞保护功能似乎是可分开的。大多数的细胞保护效应主要与aPC的抗凝活性 无关，且已生成带有最小抗凝活性以及正常细胞保护活性的aPC突变体。同样地，也已报导 高抗凝但非细胞保护性aPC突变体。
[0011] aPC轻链的C端也是高度带电区域，其在蛋白酶结构域中的活性位点的相反侧上 含有残基Glyl42-Leul55。E149A-aPC具有与野生型aPC不可区别的酰胺分解活性，但于活 化部分凝血活酶时间（aPTT)凝血分析中因为对蛋白S辅因子活性的敏感性增加而在抗凝 活性方面增加超过3倍。E149A-aPC显示在血浆凝血分析中有高活性的抗凝活性以及在体 内有高活性的抗血栓效力。该突变体在LPS诱发的致死内毒素血症鼠模型中也具有降低的 细胞保护以及死亡率降低活性。这暗示，需要aPC的细胞保护活性来降低鼠模型中的死亡 率。与之相比，aPC的抗凝活性对于死亡率降低既非必要也非足够。aPC已用于治疗败血 症，一种危及生命的与高凝血性以及综合性炎症反应相关的状况。在败血症中，aPC疗法的 严重副作用为在2%患者中所发生的大出血。这一严重的副作用限制其临床使用。
[0012] 概述 提供针对人活化蛋白C (aPC)的单克隆抗体。在至少一个实施方式中，该抗-aPC单克 隆抗体对aPC的酶原蛋白C表现最小结合。
[0013] 在一些实施方式中，所提供针对aPC的单克隆抗体已被最佳化，例如增加亲和力、 增加功能活性或降低来自种系序列的差异。
[0014] 也提供分离的单克隆抗体所结合的人aPC上的特异性表位。进一步提供编码该特 异性表位的分离的核酸分子。
[0015] 也提供包含抗-aPC单克隆抗体的药物组合物以及治疗遗传性与后天性凝血缺乏 或缺陷诸如A型及B型血友病的方法。也提供通过将抗-aPC单克隆抗体施用给有需要的 患者而缩短出血时间的方法。也提供生产结合人aPC的单克隆抗体的方法。
[0016] 附图简述 技术人员将理解，下述图仅供说明目的。附图不意欲以任何方式限制本教导的范围。
[0017] 图1显示人活化蛋白C以其成熟异二聚体形式的卡通图。
[0018] 图2显示，重链以及轻链⑶R的氨基酸序列比对在由人Fab抗体库所鉴定的10个 抗-aPC Fab中显示。
[0019] 图3描绘通过直接ELISA表征抗-APC Fab的图。ELISA板以每孔IOOng包被 人PC (hPC)、人aPC (hAPC)、犬aPC (dAPC)、小鼠aPC (mAPC)。在X轴上标出的经纯化Fab以 20nM(lug/ml)被添加至板。通过二次抗体（抗-人Fab-HRP)、继而HRP底物AmplexRed来 检测结合的Fab。经纯化Fab优先结合至人aPC，并且除了 Fab R41C17以外显示较少至不 结合人PC。一个Fab T46J23也显示与小鼠aPC的一些结合。
[0020] 图4显示利用ELISA的抗-PC Fab的结合选择性。
[0021] 图5描绘显示利用aPTT通过在人aPC中跟踪标定（spiking)而以剂量依赖性方 式抑制正常人血浆血块形成的图。50%混合的人正常血浆在52秒内形成血块。100、200、 400、800或1600ng/ml的人aPC与血浆的预温育以剂量依赖性方式延长凝血时间。观察到 重组人aPC (rh-APC)以及血浆衍生人aPC (pdh-APC)有近乎相同的效力。
[0022] 图6描绘显示在人正常血浆中抗-aPC Fab抑制人aPC并且引起血块形成的图。 400ng/ml的人aPC将血浆凝血时间从52秒延长至180秒。0、0? 5、1、2、5、10或20ug/ml的 对照抗体（对照）或其Fab (对照-Fab)或选定Fab与aPC的温育以剂量依赖性方式降低 凝血时间（上图）。也在40ug/ml测试三种Fab(R41E3、C22J13、对照-Fab)寻求更高效应 (下图）。
[0023] 图7显示在aPTT中抗-aPC Fab抑制犬aPC并且引起血块形成。
[0024] 图8显示抗-aPC Fab对于aPC的酰胺分解活性的影响。人aPC蛋白（20nM)首 先与等体积抗-aPC Fab(l-3000nM)在室温预温育20分钟，然后将最多ImM的显色底物 SPECTROZYME PCa添加至反应混合物。在Fab存在下测量最终浓度为IOnM的人aPC的酰胺 分解活性。水解率在Fab存在下受到抑制，达到80%的最大降低。
[0025] 图9显示抗-aPC Fab对于aPC的因子Va (FVa)失活活性的影响。
[0026] 图10显示利用ELISA抗-aPC人IGl的结合特异性并显示抗-aPC人IgGl的物种 交叉反应性。ELISA板以lug/ml包被人PC(hPC)、人aPC(hAPC)、犬aPC、小鼠aPC、兔aPC。 将纯化IgG (20nM)添加至板。通过二次抗体（抗-人IgG-HRP)、继而为HRP底物AmplexRed 来检测结合的IgG。五个抗-aPC人IgGl与犬和兔aPC交叉反应而一个IgGl也结合小鼠 aPC〇
[0027] 图11显示抗-aPC IgG对于物种aPC的酰胺分解活性的影响-(a)人、（b)兔、（c) 犬与（d)小鼠。a