利用骨髓间充质干细胞和/或多能干细胞的血中动员的组织再生促进剂的制作方法
【专利说明】利用骨髓间充质干细胞和/或多能干细胞的血中动员的组 织再生促进剂
[0001] 本申请是申请日为2010年10月28日、发明名称为"利用骨髓间充质干细胞和/ 或多能干细胞的血中动员的组织再生促进剂"的中国申请号为201080059712. 0的分案申 请。
技术领域
[0002] 本发明涉及投予至与需要再生的组织不同的组织中的组织再生促进剂。
【背景技术】
[0003] 再生医疗是以损伤器官的功能性、器质性再生为目的的医疗，其利用在体外进行 了培养和加工的细胞或组织。例如，皮肤培养片等是将在体外对从本人或他人采集的皮肤 细胞进行培养并加工成片状的制品移植到损伤皮肤上。再生医疗中，为了确保治疗所使用 的细胞，需要在体外对细胞进行培养增殖。通过培养操作，有可能会发生细胞的劣化（老 化、肿瘤化、细菌和病毒等的污染），因此为了维持安全性需要在保证GMP标准的设施内进 行制造，从而可预想到治疗费用的高额化将成为课题。
[0004] 另一方面，已知生物体在器官损伤时具备损伤部位的修复再生机制，但损伤部位 很大时，非功能性的疤痕组织会占据损伤部位。带有这种疤痕组织的损伤治愈在脑梗塞或 脊髄损伤中成为神经再生的抑制因子、在心肌梗塞中成为心脏破裂的要因、在大面积烧伤 或手术创伤中变为疤痕疙瘩等、在生命预后、美容方面成为明显损害QOL的原因。如果能够 活化生物体所具有的损伤组织的修复再生机制，则可以期待在不发生疤痕治愈的情况下诱 导利用功能性组织的损伤组织（器官）的再生。
[0005] 已知在骨髄内除了分化成白细胞或红细胞等的造血干细胞之外，还存在能够分化 成骨、软骨、脂肪等的间充质干细胞，近年来还得知存在能够分化成上皮系或神经系细胞的 多能干细胞。
[0006] 现有技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 专利文献 I :W02008/053892
【发明内容】
[0009] 发明要解决的技术问题
[0010] 在现有的治疗方法中，对于治愈困难的大面积皮肤溃疡、难治性骨折、脑梗塞等难 治性疾病，开发通过生理性修复再生机制的活化来诱导损伤组织的治愈的新型治疗方法成 为课题。
[0011] 用于解决技术问题的方法
[0012] 在使用小鼠确认皮肤溃疡部位治愈过程中HMGB-I及S100A8的将骨髓源性细胞 向皮肤溃疡部的动员效果时可知：通过向相对于皮肤溃疡部远且不同位置的静脉血内投予 HMGB-I或S100A8,骨髓源性细胞被动员到皮肤溃疡部位。接着，在确认HMGB-I及S100A8 的静脉内投予所产生的皮肤溃疡治愈促进效果时显示：通过将它们投予至距离溃疡部位远 且不同位置的血管内，成功地促进了皮肤溃疡的治愈。进而，在确认皮肤溃疡的非疤痕性治 愈促进效果时显示：通过将HMGB-I进行静脉内投予，可以促进已被动员至血液中的骨髓源 性细胞向溃疡部分的进一步动员，从而可以促进皮肤溃疡的早期闭合和非疤痕性治愈。
[0013] 另外，在确认脑梗塞模型小鼠脑中的骨髓源性细胞的存在时显示：对于制作脑梗 塞后静脉投予了 HMGB-I的小鼠，在脑内确认到了表达神经细胞标记物的骨髓源性细胞。接 着，在确认脑梗塞灶的缩小效果时显示：与对照小鼠相比，HMGB-I静脉投予小鼠中，对于脑 梗塞灶确认到了显著的改善效果。另外，在确认脑梗塞后的存活率改善时显示：在HMGB-I 静脉投予例中小鼠的存活率提高。
[0014] 进而，在使用小鼠确认在骨折治愈过程中骨折部以外部位的骨髓多能干细胞的相 关性时可知：损伤部位远处的骨髓源性细胞移动至骨折部分进行损伤组织的修复。
[0015] 进而，使用骨折模型小鼠评价HMGBl静脉投予所产生的骨髓间充质干细胞向损伤 部位的动员活性时可知：通过HMGBl的静脉内投予，已被动员至血中的骨髓间充质干细胞 聚集至骨折部分。
[0016] 本申请基于上述所知而提供以下的发明。
[0017] (1) 一种药剂，其为含有以下（a)~（q)中任一项所述的物质的组织再生促进剂， 且其被投予至与需要再生的组织不同的组织；
[0018] (a)HMGBl 蛋白质
[0019] (b)分泌HMGBl蛋白质的细胞
[0020] (c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体
[0021] (d)HMGB2 蛋白质
[0022] (e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
[0023] (f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
[0024] (g)HMGB3 蛋白质
[0025] (h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
[0026] (i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
[0027] (j)S100A8 蛋白质
[0028] (k)分泌S100A8蛋白质的细胞
[0029] (1)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
[0030] (m)S100A9 蛋白质
[0031] (η)分泌S100A9蛋白质的细胞
[0032] (〇)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
[0033] (ρ)细胞或组织的提取液
[0034] (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
[0035] (2)上述（1)所述的药剂，其被非经口投予。
[0036] (3)上述（2)所述的药剂，其为注射投予。
[0037] (4)上述⑴所述的药剂，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。
[0038] (5)上述（1)~（4)任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取液是通过包含将 细胞或组织浸渍在溶剂中的工序的方法来制造。
[0039] (6)上述⑴~⑷任一项所述的药剂，其中，细胞或组织的提取液的肝素结合级 分是通过包含以下工序的方法来制造：
[0040] (a)将细胞或组织浸渍在溶剂中的工序、
[0041] (b)使工序（a)中获得的提取液与固定化肝素接触的工序、和
[0042] (C)从固定化肝素中洗脱肝素结合级分的工序。
[0043] (7)上述（1)~（6)任一项所述的药剂，其被用于神经组织、骨组织或皮肤组织的 再生促进。
[0044] (8) -种组织再生促进试剂盒，其包含含有以下（a)~（q)中任一项所述的物质的 组合物，该组合物被投予至与需要再生的组织不同的组织；
[0045] (a)HMGBl 蛋白质
[0046] (b)分泌HMGBl蛋白质的细胞
[0047] (c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体
[0048] (d)HMGB2 蛋白质
[0049] (e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
[0050] (f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
[0051] (g)HMGB3 蛋白质
[0052] (h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
[0053] ⑴插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
[0054] (j)S100A8 蛋白质
[0055] (k)分泌S100A8蛋白质的细胞
[0056] (1)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
[0057] (m)S100A9 蛋白质
[0058] (η)分泌S100A9蛋白质的细胞
[0059] (〇)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体 [0060] (P)细胞或组织的提取液
[0061] (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
[0062] (9)上述⑶所述的试剂盒，其被非经口投予。
[0063] (10)上述（9)所述的试剂盒，其为注射投予。
[0064] (11)上述⑶所述的试剂盒，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。
[0065] (12)上述⑶~（11)任一项所述的试剂盒，其被用于神经组织、骨组织或皮肤组 织的再生促进。
[0066] (13) -种促进组织再生的方法，其包含：将有效量的含有以下（a)~（q)中任一 项所述的物质的组合物投予至与需要再生的组织不同的组织的工序；
[0067] (a)HMGBl 蛋白质
[0068] (b)分泌HMGBl蛋白质的细胞
[0069] (c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体
[0070] (d)HMGB2 蛋白质
[0071] (e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
[0072] (f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
[0073] (g)HMGB3 蛋白质
[0074] (h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
[0075] ⑴插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
[0076] (j)S100A8 蛋白质
[0077] (k)分泌S100A8蛋白质的细胞
[0078] (1)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
[0079] (m)S100A9 蛋白质
[0080] (η)分泌S100A9蛋白质的细胞
[0081] (〇)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
[0082] (ρ)细胞或组织的提取液
[0083] (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
[0084] (14)上述（13)所述的方法，其中，为非经口投予。
[0085] (15)上述（14)所述的方法，其中，为注射投予。
[0086] (16)上述（13)所述的方法，其中，向血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内进行投 予。
[0087] (17)上述（13)~（16)任一项所述的方法，其促进神经组织、骨组织或皮肤组织的 再生。
[0088] (18) -种含有以下（a)~（q)中任一项所述的物质的组合物在组织再生促进剂的 制造中的用途，其中，该组织再生促进剂被投予至与需要再生的组织不同的组织；
[0089] (a)HMGBl 蛋白质
[0090] (b)分泌HMGBl蛋白质的细胞
[0091] (c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体
[0092] (d)HMGB2 蛋白质
[0093] (e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
[0094] (f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
[0095] (g)HMGB3 蛋白质
[0096] (h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
[0097] (i)插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
[0098] (j)S100A8 蛋白质
[0099] (k)分泌S100A8蛋白质的细胞
[0100] (1)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
[0101] (m)S100A9 蛋白质
[0102] (η)分泌S100A9蛋白质的细胞
[0103] (〇)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
[0104] (P)细胞或组织的提取液
[0105] (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
[0106] (19)上述（18)所述的用途，其中，所述组织再生促进剂被非经口投予。
[0107] (20)上述（19)所述的用途，其中，为注射投予。
[0108] (21)上述（18)所述的用途，其中，所述组织再生促进剂被投予至血管内、肌肉内、 皮下、皮内或腹腔内。
[0109] (22)上述（18)~（21)任一项所述的用途，其中，所述组织再生促进剂为神经组 织、骨组织或皮肤组织的再生促进剂。
[0110] (23) -种组合物，其为用于在促进组织再生的方法中使用的、含有以下（a)~（q) 中任一项所述的物质的组合物，其被投予至与需要再生的组织不同的组织；
[0111] (a)HMGBl 蛋白质
[0112] (b)分泌HMGBl蛋白质的细胞
[0113] (c)插入有编码HMGBl蛋白质的DNA的载体
[0114] (d)HMGB2 蛋白质
[0115] (e)分泌HMGB2蛋白质的细胞
[0116] (f)插入有编码HMGB2蛋白质的DNA的载体
[0117] (g)HMGB3 蛋白质
[0118] (h)分泌HMGB3蛋白质的细胞
[0119] ⑴插入有编码HMGB3蛋白质的DNA的载体
[0120] (j)S100A8 蛋白质
[0121] (k)分泌S100A8蛋白质的细胞
[0122] (1)插入有编码S100A8蛋白质的DNA的载体
[0123] (m)S100A9 蛋白质
[0124] (η)分泌S100A9蛋白质的细胞
[0125] (〇)插入有编码S100A9蛋白质的DNA的载体
[0126] (P)细胞或组织的提取液
[0127] (q)细胞或组织的提取液的肝素结合级分。
[0128] (24)上述（23)所述的组合物，其被非经口投予。
[0129] (25)上述（24)所述的组合物，其中，为注射投予。
[0130] (26)上述（23)所述的组合物，其被投予至血管内、肌肉内、皮下、皮内或腹腔内。
[0131] (27)上述（23)~（26)任一项所述的组合物，其中，促进组织再生的方法是促进神 经组织、骨组织或皮肤组织的再生的方法。
[0132] 发明效果
[0133] 作为损伤组织再生药品，已知HGF、EGF、VEGF、FGF等细胞增殖因子，但这些物质是 被直接投予至损伤部位及其附近组织以期待促进细胞增殖来进行使用的。
[0134] HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9具有动员骨髓多能干细胞的活性。骨髓多能 干细胞除了能分化成间充质细胞之外，还可分化成上皮系或神经系的细胞。在大面积的组 织损伤时，只要能够介由血流将骨髓多能干细胞动员至损伤部位，则可期待促进骨髓多能 干细胞所带来的生理性损伤组织的修复再生。
[0135] 通过本发明，提供了下述方法：通过利用静脉内投予等方法将作为骨髓多能干细 胞动员因子的HMGB1、HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9投予至远离损伤部位的远处部位，从而 将骨髓多能干细胞动员至末梢血中，由此促进损伤组织修复。例如，在治疗如脑梗塞那样的 体内深部器官的疾病时，很难将治疗药直接投予至损伤部位（脑）。而本发明中，由于使在 通常诊疗中广泛实施的静脉投予的治疗成为可能，因而可以以任意的次数、浓度将治疗药 安全且简便地投予，这是比现有的治疗方法更优异的效果。
[0136] 另外，作为最近开发出的使用了骨髄细胞的脑梗塞的治疗方法，已知从患者本人 的骨髄采集细胞并再次投予到血液循环中的方法是有效的，但在采集骨髄细胞时由于需要 将很粗的针刺入体内深部的骨髄进行抽吸，因而不可避免地伴有严重的侵袭。与此相对，在 本发明中，通过将药剂进行静脉内投予，可以将骨髄细胞直接动员至血液循环中，因而即便 多次向脑梗塞患者投予，也不会伴有严重的侵袭。
[0137] 骨髄来源的多能干细胞具有分化成间充质细胞、上皮系细胞、神经系细胞等多种 细胞的潜在能力，认为在移动至损伤部位后根据周围的微环境进行分化并诱导组织修复。 在再生医疗或细胞治疗中，是在生物体外将稀少的骨髓多能干细胞进行培养并使其增殖 后用于治疗，但与以往的药品不同，由于具有在培养过程中可能发生的细胞的劣化（癌化 或细菌、病毒等的污染）的危险，因而需要充分的安全管理。本发明中，通过投予HMGB1、 HMGB2、HMGB3、S100A8、S100A9而将骨髓多能干细胞动员至末梢循环血内，但由于不需要将 细胞取出至体外以施加人工操作，因而是安全性高的治疗方法。
【附图说明】
[0138] 图1为表示HMGBl的纯化过程的照片。将在HMGBl的N末端侧含有利用GST-标 签6XHis-标签HRV3C获得的剪切序列的表达载体转染至HEK293。使培养上清结合于镍柱， 用咪唑对结合级分进行洗脱。进而，将镍柱结合级分利用HRV3C从HMGBl中剪切GST-标 签6XHis标签后，使其结合在肝素亲和柱上，利用氯化钠进行洗脱。使肝素结合级分结合在 Q柱上，利用氯化钠进行洗脱。为了检测各个纯化过程的纯化度，对结合在柱上的级分进行 SDS-PAGE后，进行考马斯染色。
[0139] 图2为表示溃疡闭合后的皮肤和皮肤的薄切片的GFP信号的照片。在GFP骨髄移 植小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静脉投予HMGBl或S100A8。经静脉投予了 HMGBl和S100A8 的小鼠的皮肤上与对照相比，检测到更多量的为GFP阳性的骨髓源性细胞。
[0140] 图3为表示经时测定的皮肤溃疡面积的曲线。在小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静 脉投予HMGBl或S100A8。制作溃疡后第3天，与对照组相比，在HMGBl投予组中可见皮肤 溃疡的缩小效果。在制作溃疡后第7天，与对照组相比，在S100A8投予组中可见皮肤溃疡 的缩小效果（纵轴：溃疡面积+皮肤溃疡制作时的面积X 100,横轴：皮肤溃疡制作后的天 数）。
[0141] 图4为表示皮肤溃疡闭合后对皮肤的薄切片进行了苏木精伊红染色（HE)、Masson 三色染色（MT)后的结果的照片。在小鼠的背中制作皮肤溃疡，经静脉投予HMGB1。在对照 小鼠中可见胶原纤维异常增加，而经静脉投予了 HMGBl的小鼠中抑制了胶原纤维的异常增 加。
[0142] 图5为表示巢蛋白（神经干细胞标记物）和β III微管蛋白（神经元标记物）表 达细胞的检测结果的照片。在GFP骨髄移植小鼠中制作脑梗塞，经静脉投予HMGBl来进行 治疗。治疗结束后，制作脑的薄切片进行免疫组织化学。左侧照片的箭头所示的细胞为GFP 阳性且巢蛋白阳性的细胞。右侧照片的箭头所示的细胞为GFP阳性且MII微管蛋白阳性 的细胞。确认了骨髄来源的细胞表达神经标记物。
[0143] 图6为表示梗塞部位的检测结果的照片。制作脑梗塞疾病模型小鼠，经静脉投予 HMGB1。治疗结束后，制作脑的薄切片，进行尼氏染色。在PBS投予例（对照）中皮质可见 坏死的组织，在HMGBl治疗例中皮质未见坏死的组织。
[0144] 图7为表示脑梗塞制作后7天的存活率的曲线。制作脑梗塞疾病模型小鼠（缺血 45分钟、缺血60分钟）后，进行经静脉投予HMGBl所实施的治疗。在缺血45分钟、缺血60 分钟的任一情况下，都确认了通过利用HMGBl的治疗所带来的存活率的改善。
[0145] 图8为表示在通过皮肤结合的GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠中，GFP骨髄嵌合 体小鼠的骨髄细胞移动至野生型小鼠的右足骨折部位并分化成成骨细胞的照片。通过皮肤 将GFP骨髄移植小鼠和野生型小鼠结合、在野生型小鼠中制作骨折。在骨折部位的治愈后， 在表达骨钙素的成骨细胞中存在GFP阳性细胞。教示了：在骨折的治愈过程中，距离损伤部 位远的骨髓源性细胞移动至骨折部位并分化成成骨细胞，从而进行生理性损伤治愈。
[0146] 图9为表示在向GFP骨髄移植小鼠背部移植皮肤后所观察到的对移植皮肤片的 GFP荧光聚集的照片。上面左侧的照片表示皮肤移植部的肉眼图像、上面中央的照片表示在 移植皮肤与受体皮肤的边界部（用"丨"表示的部分）附近处受体皮肤的HE组织图像、上 面右侧照片表示植皮皮肤的HE组织图像。另外，下面左侧照片表示对植皮皮肤的GFP荧光 的聚集、下面中央的照片表示植皮部的放大图像、下面右侧照片表示对该放大部皮肤的GFP 荧光的聚集。
[0147] 图10为表示在GFP骨髄移植小鼠背部上的移植皮肤片中聚集的骨髄来源的表皮 细胞、骨髄来源的真皮成纤维细胞的照片。左侧开始第1列是DAPI染色（核染色），上面 的照片表示植皮部皮肤的弱放大图像（100倍）；中间照片以其强放大图像（200倍）表示 表皮/真皮边界部；下面以其强放大图像（200倍）表示毛囊部。左侧开始第2列表示第1 列的各个区域的GFP荧光图像、左侧开始第3列表示其角蛋白5 (K5)的免疫染色图像、左侧 开始第4列表示将各个荧光重叠后的图像（Merge)。观察到了多个GFP阳性表皮细胞和真 皮成纤维细胞。
[0148] 图11为表示使用了 Boyden小室的皮肤提取液的骨髄来源间充质干细胞迀移能力 活性测定结果的照片。上面左侧照片是使用蓝色色素对骨髓间充质干细胞进行了染色的图 像，所述骨髓间充质干细胞从Boyden小室的上槽内通过硅膜上的微孔迀移至皮肤提取液 侧