脱细胞生物网膜的制备方法及由其制得的脱细胞生物网膜的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组织工程与生物医用材料技术领域，具体涉及脱细胞生物网膜的制备方法及由其制得的脱细胞生物网膜。
【背景技术】
[0002]细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是结构蛋白和功能蛋白的复杂复合物，包含多种纤维蛋白，如胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白、蛋白多糖等组分，其组分在不同物种间相对保守。细胞外基质作为细胞生长支架，在细胞粘附、增殖和分化方面发挥着重要作用。在组织工程研宄领域，为了更好的模拟天然细胞外基质的三维微环境，近年来，研宄人员开发了系列通过脱细胞技术得到脱细胞基质生物支架材料的技术与方法。
[0003]脱细胞策略主要是指利用脱细胞技术(物理、化学、酶解等方法)去除组织中各种细胞成分以及遗传物质从而获得天然生物支架材料。脱细胞基质材料相对于传统生物支架材料来说具有诸多优势，主要包括，I)细胞外基质的三维结构保留完整；2)天然细胞外基质组成成分得以保留，利于细胞生长及功能发挥；3)脱细胞支架材料中含有天然细胞外基质中的细胞因子和信号分子，可以增强细胞的功能并促进生物学功能；4)脱细胞过程能够降低细胞外基质免疫原性，利于异种来源的组织的治疗性应用，扩展了供体的来源；5)脱细胞基质具有生物可降解性，不引发炎性反应。正是由于以上优势，脱细胞基质生物支架材料研宄近年来得到了国内外研宄人员的广泛关注并取得系列突破性进展，成功应用于组织工程各个领域。目前，人们已经能够从多种组织中得到脱细胞基质支架材料，如小肠、皮肤、血管、角膜以及更为复杂心、肺、肝、肾等。
[0004]大网膜是腹膜的一种，是存在于高等动物腹腔中的一层黏膜，是由结缔组织形成的膜状组织。大网膜是连接胃大弯至横结肠的腹膜。大网膜富有极强的弹性以及高度血管化的结构，这些优点使其在组织工程与再生医学领域中具有广泛的应用前景。目前，大网膜脱细胞相关研宄刚刚起步，还存在诸多问题亟待解决。由于大网膜组织的结构和功能与皮肤、血管、瓣膜等组织存在较大差别，传统的脱细胞方法，如反复冻融法、表面活性剂法、酶消化法等不能完全适用于大网膜组织的脱细胞处理。并且方法步骤繁琐，成本高，不适用于批量制作。因此，目前需要开发一种能最大程度保留大网膜细胞外基质组成与成分，且方法简单，成本低廉的大网膜脱细胞方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种操作方法简单、成本低廉的大网膜脱细胞方法。利用该方法得到大网膜脱细胞基质能够保留大网膜细胞外基质组成与成分，具有良好的生物相容性。
[0006]根据本发明的一个方面，提供了脱细胞生物网膜的制备方法，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤。
[0007]根据本发明的另一方面，提供了脱细胞生物网膜的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行:
[0008](I)脱脂溶液的配制
[0009]将甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1:1: 0.2-1的比例混匀；
[0010](2)脱细胞液的配制
[0011]I)脱细胞液1:称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5-3.5%重量比，DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为 3500-4500U/L，pH 为 7.2-7.4，过滤除菌；
[0012]2)脱细胞液I1:称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6-1.5%重量比，DNA酶在PBS中的浓度为2500-3500U/L，pH 为 7.2-7.4，过滤除菌；
[0013]3)脱细胞液II1:称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.6%重量比，DNA酶在PBS中的浓度为1500-2500U/L，pH 为 7.2-7.4，过滤除菌；
[0014](3)大网膜脱细胞处理
[0015]I)取新鲜的大网膜组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r/min ；
[0016]2)将去除脂肪的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液I中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min ；
[0017]3)将经脱细胞液I处理后的所述大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于脱细胞液II中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min ；
[0018]4)将经脱细胞液II处理后的大网膜组织于磷酸盐缓冲液中清洗，并震荡浸泡于所述脱细胞液III中处理，浸泡时间为4-12h，震荡频率为100-200r/min ；
[0019]5)将经脱细胞液III处理后的所述大网膜组织经冷冻干燥后灭菌。
[0020]本发明的方法采用梯度洗脱与物理震荡相结合的方法对大网膜进行脱细胞处理，与现有的脱细胞方法相比，本发明的方法条件温和，提高了大网膜脱细胞效率，同时最大程度的保留了大网膜脱细胞基质的组成；本方法还具有操作简单、可实施性强的优点。
[0021]根据本发明的另一方面，提供了根据上述方法获得的脱细胞生物网膜。
【附图说明】
[0022]图1脱细胞生物网膜I型胶原免疫组织化学染色X200。
[0023]图2脱细胞生物网膜IV型胶原免疫组织化学染色X 200。
[0024]图3脱细胞生物网膜纤维连接蛋白疫组织化学染色X200。
[0025]图4脱细胞生物网膜弹性蛋白疫组织化学染色X200。
[0026]图5天然大网膜组织与脱细胞生物网膜中的DNA含量检测(*p < 0.01)。
【具体实施方式】
[0027]在本申请中，缩写词的含义如下:
[0028]SDS:十二烷基硫酸钠；
[0029]PBS:磷酸盐缓冲液；
[0030]DNA酶:脱氧核糖核酸酶；
[0031]min:分钟。
[0032]根据本发明的一个方面，提供了脱细胞生物网膜的制备方法，其包括使用含十二烷基硫酸钠与DNA酶的缓冲液浸泡大网膜进行脱细胞处理的步骤。
[0033]在某些实施方案中，在进行脱细胞处理的步骤中还进行震荡。
[0034]在某些实施方案中，还包括脱脂处理的步骤。在示例性实施方案中，脱脂处理的步骤在脱细胞处理的步骤之前进行。在某些优选的实施方案中，该脱脂处理的步骤使用体积比为1:1: 0.2-1的甲醇、氯仿和乙醚的混合溶液进行。在某些更优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1:1: 0.4-0.7。在最优选的实施方案中，甲醇、氯仿和乙醚的体积比为1:1: 0.5。
[0035]在某些实施方案中，脱细胞处理的步骤是分梯度进行的，所述梯度包括至少第一梯度和第二梯度。
[0036]在某些优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-3.5%重量比，DNA酶的浓度为3500-4500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.5-2.5%重量比，DNA酶的浓度为3600-4400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.8-2.2%重量比，DNA酶的浓度为3800-4200U/L。在最优选的实施方案中，在第一梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为2.0 %重量比，DNA酶的浓度为4000U/L。
[0037]在某些优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.6-1.5%重量比，DNA酶的浓度为2500-3500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.7-1.3%重量比，DNA酶的浓度为2600-3400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.8-1.2%重量比，DNA酶的浓度为2800-3200U/L。在最优选的实施方案中，在第二梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为1.0 %重量比，DNA酶的浓度为3000U/L。
[0038]在某些优选的实施方案中，所述梯度还包括第三梯度，其中在所述第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.1-0.6%重量比，DNA酶的浓度为1500-2500U/L，pH为7.2-7.4。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.2-0.6%重量比，DNA酶的浓度为1600-2400U/L。在某些更优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.4-0.6%重量比，DNA酶的浓度为1800-2200U/L。在最优选的实施方案中，在第三梯度中，十二烷基硫酸钠的浓度为0.5%重量比，DNA酶的浓度为2000U/L。
[0039]根据本发明的另一方面，提供了脱细胞生物网膜的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行:
[0040](I)脱脂溶液的配制
[0041]将甲醇、氯仿与乙醚以体积比为1:1: 0.2-1的比例混匀；
[0042](2)脱细胞液的配制
[0043]I)脱细胞液1:称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为1.5-3.5%重量比，DNA酶在磷酸盐缓冲液中的浓度为 3500-4500U/L，pH 为 7.2-7.4，过滤除菌；
[0044]2)脱细胞液I1:称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.6-1.5%重量比，DNA酶在PBS中的浓度为2500-3500U/L，pH 为 7.2-7.4，过滤除菌；
[0045]3)脱细胞液II1:称取十二烷基硫酸钠及DNA酶，溶解于磷酸盐缓冲液中，其中，十二烷基硫酸钠在磷酸盐缓冲液中的浓度为0.1-0.6%重量比，DNA酶在PBS中的浓度为1500-2500U/L，pH 为 7.2-7.4，过滤除菌；
[0046](3)大网膜脱细胞处理
[0047]I)取新鲜的大网膜组织，于磷酸盐缓冲液中清洗，将清洗后的组织震荡浸泡于所述脱脂溶液中处理，脱脂溶液浸泡时间为18-30h，震荡频率为150-250r