一种抗凝血快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学功能材料制备技术领域，特别是获得了一种能够抗凝血、快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法，制备得到的多功能具有良好血液相容性和细胞相容性，可作为血管支架材料表面改性方法。
【背景技术】
[0002]伴随着心血管疾病的发病率不断攀升，人们对CVD的关注不断增强，这种发病的趋势往往是由于人们的生活水平提高、生活方式的改变、人口老年化加快以及周围环境的改变所致。冠心病是常见的一种心血管疾病，由于给心脏供血的冠状动脉硬化从而导致心肌供血不足或心肌缺血的疾病，主要是由于炎症细胞(巨噬细胞)与血管壁造成内膜增生的平滑肌细胞、脂质(胆固醇和脂肪酸)以及钙盐在冠状动脉内沉积形成斑块而恶化引发疾病。
[0003]冠心病的治疗成为现代医学技术发展的一大主要任务，治疗的根本目的在于改善和消除症状并且降低并发症。对于介入治疗中植入材料的改性则成为研宄重点，支架的植入必须面临形成创伤，创口带来血管壁的损伤，进而导致快速凝血和内膜增生，从而形成再狭窄。所以，支架材料表面改性的研宄成为解决这些问题的关键。因此制备一种能够抗凝血、快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层具有重要意义。
【发明内容】
[0004]鉴于以上背景要求，本发明的目的是获得一种能够抗凝血、快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备技术。目标物涂层的制备具有更好的生物相容性和血液相容性。制备过程简单，条件温和，适合于大规模生产。
[0005]本发明为解决其技术问题，所采用的步骤如下:
[0006]一种抗凝血快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法，包含以下步骤:
[0007](I)支架的制备与清洗:支架经过泡酸，过夜后将样品取出用清水冲洗，然后依次用无水乙醇和蒸馏水RO超声清洗三次，每次5min，干燥备用；
[0008](2)酸活化:烧杯中配制浓硫酸和双氧水(V:V = 3:1) 20ml的酸性活化剂，将已经干燥的支架浸没在酸性溶液中80°C下恒温2h进行羟基化处理，再取出用蒸馏水进行充分清洗后干燥，得到活化后表面富含羟基的表面；
[0009](3)硅烷偶联:配制3% APTE无水乙醇溶液，将⑵活化后的样品放入APTE溶液中50°C下反应12h得到富含氨基的表面，样品经无水乙醇、RO水清洗后在真空下120°C固化反应2h得到固定APTE的表面，样品，标记为G0APTE ；
[0010]⑷EDC交联F/Ln:用EDC/NHS/PBS体系配制不同浓度比例的岩藻聚糖(Fucoidan, F)/层黏连蛋白(Ln)溶液，然后立即吸取50 μ I于每个样品表面在37°C下反应2h，活化固定于支架表面形成表面膜，得到具备抗凝血促内皮且抑增生的多功能支架涂层目标物。
[0011]采用本发明方法制备的心血管支架多功能涂层，具有优异的抗凝血能力，显著降低血小板的激活程度，并且能够达到促进材料表面快速内皮化和成管的能力，因此能够降低晚期血栓，避免突发性死亡事件的发生。
[0012]本发明的机理是:
[0013]通过在材料表面制备具有某些化学基团如-0H、-NH3、-C00H、-SO3H, C = O等可以调节材料表面的电荷与亲疏水性和加强细胞的粘附和生长能力。目前在材料表面制备氨基常用方法是多聚赖氨酸(PLL)和硅烷化制备氨基表面，而硅烷化相比于PLL载玻片具有制备工艺简单、成本低和保存时间长等优点。3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane, ΑΡΤΕ)是一种常用的氨基娃烧偶联剂，常用于钛片、玻璃硅片表面的氨基修饰，在生物医学工程和微流控芯片方面有着广泛应用，采取EDC/NHS偶联剂作为共价级联反应，能够加快和稳定接枝羧基蛋白于氨基表面。岩藻聚糖硫酸酯是一种带负电荷的硫酸化多糖，其作用于抗凝血活性与机理的研宄已经非常深入，不仅可以抑制血小板粘附，还会在体外内皮细胞培养时诱导内皮细胞释组织因子途径抑制因子(TFPI)，从外源凝血途径而发挥抗血栓作用。除了抗凝血功能外，岩藻聚糖作用于血管时还能够提升成纤维细胞生长因子(FGF-2)促进血管再生。层粘连蛋白作为基膜的只要成分之一，用于研宄仿生基膜可以促进内皮细胞的粘附与增殖加快血管形成。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点如下:
[0015]1、传统的材料表面改性的方法，是在材料表面构建单功能的仿生涂层，往往只具备抗凝血或促内皮单一功能，对多功能的作用很少能同时实现。
[0016]2、本发明利用的Ln/Fucoidan构建的多功能涂层还未在这之前有过相关报道，是一种非常新颖的多功能涂层构建方法。
[0017]3、岩藻聚糖发挥抗凝血作用的途径是多方面的，协同外源性凝血与内源性凝血途径共同作用，具有非常高效的抗凝血效果。其在抗凝血同时具备保护内皮作用，可以更好加速内皮化。低分子量岩藻聚糖Fucoidan，具有优异的抗凝血性能，并且抑制炎性反应，平滑肌SMCs的生长和降低蛋白水解，可用于炎性患者的治疗，还有一些研宄表明低分子盐藻聚糖通过FGF-2和VEGF参与血管再生，是一种优于肝素的抗凝血的生物分子。
[0018]4、本发明制备的涂层均匀厚度小于50nm，原料投入较小，并且还可以在材料表面进行各生物分子含量的调控，因此本发明、制备方法条件温和、操作简便，适用性较强，成本低廉可靠。
【附图说明】
[0019]图1酸性橙定量硅烷化后氨基浓度；
[0020]图2 QCM-D实时动态监测Ln/F薄膜组装过程质量变化；
[0021]图3 XPS表针材料表面基团结果；
[0022]图4不同条件处理表面血小板粘附激活形态图:(a)纯Glass表面(b)硅烷化G@APTE表面(c) Ln/F涂层表面；
[0023]图5 (a)内皮细胞培养CCK-8计数值；(b)平滑肌细胞培养CCK-8计数值。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图对本发明的技术方案进行详细描述。
[0025]需要说明的是，支架可以由现有的常规材料充当，比如:惰性材料陶瓷，合金材料镍钛合金，金属不锈钢和氧化钛等，以下材料选择无副作用影响的玻片作为研宄对象，避免材料本身对本发明造成影响，但实际支架材料的选择则应用广泛。
[0026]QCM-D实施方案I
[0027]1.将Si02晶片在紫外下照射1min ；
[0028]2.然后用SDS，UP水依次清洗QCM-D通道；
[0029]3.放置样品，然后打开软件，设置好温度37°C，检测仪器灵敏度；
[0030]4.开始跑空气，检测QCM-D晶片是否完好；然后通入无水乙醇；
[0031]5.待基线跑平后，通3% APTE无水乙醇溶液获得较为平的基线后，通入乙醇溶液溶液清洗，再通入PBS清洗晶片；
[0032]6.最后基线跑平后，通入Ln/Fucoidan溶液，观察薄膜耗散变化，带稳定后，最后融入PBS溶液进行清洗，实验结束，分析数据。
[0033]QCM-D实施方案2
[0034]1.利用晶片制备APTE表面；
[0035]2.然后用SDS，UP水依次清洗QCM-D通道；
[0036]3.放置样品，然后打开软件，设置好温度37°C，检测仪器灵敏度；
[0037]4.开始跑空气，检测QCM-D晶片是否完好；然后通入PBS缓冲液
[0038]5.待基线跑平后，通通入Ln/Fucoidan溶液，获得组装薄膜的基线；
[0039]实施例1
[0040]1.将玻片依次用酒精(无水乙醇)，RO水(去离子水)超声清洗三次，每次lOmin，然后干燥处理；
[0041]2.将玻片羟基化处理:将玻片放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比(V%:V%= 7:3)在80°C中浸泡Ih ;然后用RO水清洗3次，每次5min ；
[0042]3.然后立即将上述样品放到3% APTE