用于预防和治疗癌症的msi-特异性移码肽(fsp)的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明提供了一种用于预防和治疗以微卫星不稳定性（MSI)为特征的癌症的疫 苗。该疫苗包含一种MSI-特异性移码肽（FSP)或编码所述FSP的核酸，所述FSP产生针对 肿瘤细胞的体液应答或细胞应答。
【背景技术】
[0002] 人类肿瘤通过两种主要的基因组不稳定性的路径形成：染色体不稳定性和由于 DNA错配修复系统的缺陷导致的微卫星不稳定性（MSI)。15%的结直肠癌和各种显示有缺 陷的DNA错配修复系统的肠外恶性肿瘤，包括子宫内膜癌、胃癌、小肠癌和其他器官的肿瘤 都呈现 MSI。MSI癌症可偶发地形成或出现在遗传性肿瘤综合征、遗传性非息肉病性结直肠 癌（HNPCC)或Lynch综合征中。
[0003] MSI结直肠肿瘤的特征是高免疫原性，其源自当基因编码区的微卫星受到突变影 响时，作为导致翻译阅读框改变的错配修复缺陷的直接结果，在MSI肿瘤的形成过程中产 生了许多移码肽（FSP)(图1)。
[0004] 大量可预见的MSI-特异性FSP抗原以及它们直接来自恶性转化过程的事实使FSP 成为免疫治疗极具潜力的靶标。人们相信人类免疫系统是一种潜在的可以消除肿瘤细胞的 资源，并且如果适当刺激免疫系统的组件来识别并清除癌细胞，则可以形成有效的治疗。因 此，免疫疗法，其包括直接或间接地激活人体的免疫系统的组成物和方法以缩小或消除癌 症，已经作为传统癌症治疗方法的辅助方法被研宄多年。
[0005] 人们普遍承认肿瘤的生长和转移主要取决于它们逃避宿主免疫系统的能力。大多 数肿瘤表达在不同程度上能被宿主免疫系统识别的抗原，但在许多情况下，免疫应答是不 充分的。肿瘤抗原的弱免疫原性或肿瘤细胞共刺激分子的不恰当表达或者表达缺失可导致 不能够引发效应T-细胞的强烈活化。对于大多数的T-细胞，白细胞介素（IL)-2的生产和 增殖需要一个T细胞抗原受体（TCR)同时参与的共同刺激信号，否则，T细胞会进入一个被 称作克隆无能的功能无反应状态。
[0006] 尽管研宄这些治疗方法很长时间，但仍需要改进方案以增强针对肿瘤抗原的免疫 应答。
[0007] 然而，在本领域存在能够刺激免疫系统成为肿瘤免疫疗法的安全且有效的组合的 需求。
【发明内容】
[0008] 根据本发明，作为肿瘤免疫疗法的免疫系统的安全且有效的刺激物通过在权利 要求书中限定的主题而实现。体外数据表明，FSP具有高免疫原性，在体外能诱发显著的 FSP-特异性 T 细胞应答（Linnebacher 等，2001，Ripberger 等，2003, Schwitalle 等，2004)。 对采自MSI结肠癌患者的外周血的进一步研宄证明FSP-特异性T细胞应答频率较高。尽 管肿瘤和外周血中有大量的FSP-特异性T细胞，患者并没有任何自身免疫体征，这暗示FSP 疫苗接种途径在自身免疫方面预期不会产生副作用。
[0009] 对于携带易患遗传性非息肉性结直肠癌（HNPCC)的DNA错配修复基因的种系突变 的个体的免疫分析，也被发现具有针对FSP的细胞免疫应答，即使未出现临床可检测到的 肿瘤。这暗示FSP-特异性免疫应答对于HNPCC个体可具有保护作用，表明FSP疫苗接种也 可作为非遗传性癌症的第一个特异性预防途径用于预防性设置（setting)中。
[0010] 简要地说：
[0011] (a)移码肽（FSP)是MSI-特异性的且由MSI肿瘤发病机制直接导致；
[0012] (b)预计没有临床相关副作用；
[0013] (c)FSP的组合被预计靶向全部具有MSI的肿瘤；
[0014] (d)FSP疫苗接种已被设计成治疗15%的结肠癌和子宫内膜肿瘤、胃肿瘤、小肠肿 瘤和其他器官肿瘤；
[0015] (e)分子肿瘤分析能够确定可受益于FSP疫苗接种（靶向治疗）的患者；以及
[0016] (f)FSP疫苗接种可被用作高危群体的预防性疫苗接种。
【附图说明】
[0017] 图1为DNA错配修复缺陷导致的编码微卫星不稳宙件的示意件说明（Kloor等， 2010)
[0018] 当编码微卫星突变导致翻译阅读框改变时产生包括FSP序列的截短蛋白（红色）
[0019] (例如：TGFBR2 蛋白）。
[0020] 图2为针对新设计的在来自三个MSI结肠癌患者的外周血中的FSP的示例件T细 朐应答。
[0021] S 3 ^#ΜΑλΑΙΜ2(-1).HT001 (-1).TAFlB (-1) TGFBR2 (~1) 免痔应答。
[0022] 酶联免疫吸附试验实验（ELISA)揭示针对来自ΑΜ2(-1)、ΗΤ001 (-1)、TAFlB (-1) 和TGFBR2(-1)的新肽（neop印tide)的FSP-特异性抗体应答。如先前所述通过预吸收各 自的血清抗体证明了肽的特异性（Reuschenbach等，2008)。
[0023] 图4为通i寸CD107a表而表汰确宙的细朐毒件应答。
[0024] ㈧在用抗原刺激T细胞四个星期后，在不同健康个体中观察到显著的FSP-特异 性应答。应答只发生在存在抗原提呈B细胞和FSP抗原的情况下。代表性应答如条形图所 不O
[0025] (B)在不存在（左面板）或存在（右面板）FSP抗原HT001 (-1)的情况下，对于接 种作为抗原提呈细胞的B细胞的T细胞的CD107a测试的代表性FACS (荧光激活细胞分选 仪）分析。
【具体实施方式】
[0026] 因此，本发明提供了一种包含MSI肿瘤特异性移码肽（FSP)或编码所述FSP的核 酸的疫苗，该移码肽例如源自TAFlB (登记号L39061)、HT001 (登记号AFl 13539)、AM2 (登 记号AF024714)、或TGFBR2 (登记号NM_ 003242)，其中FSP能诱发针对呈现MSI的癌症的 免疫应答。
[0027] 在优选的实施方式中，本发明的疫苗包含
[0028] (a)包含以下氨基酸序列的FSP或者由以下氨基酸序列构成的FSP :
[0029] NTQIKALNRGLKKKTILKKAGIGMCVKVSSIFFINKQP (TAF1B (~1))；
[0030] EIFLPKGRSNSKKKGRRNRIPAVLRTEGEPLHTPSVGMRETTGLGC(ΗΤ001(~1))；
[0031] HSTIKVIKAKKKHREVKRTNSSQLV(AIM2(-1))；
[0032] 或
[0033] ASPKCIMKEKKSLVRLSSCVPVALMSAMTTSSSQKNITPAILTCC(TGFBR2(~1))：
[0034] (b) (b)的FSP的功能等同物；或
[0035] (c) (a)的 FSP 和 / 或（b)的 FSP 的组合。
[0036] 这里使用的术语"功能等同物"涉及例如FSP的变体或片段，其仍能诱发对抗肿瘤 的免疫应答，即仍可以作为有效疫苗。免疫应答被定义为满足下列标准中的至少一个标准 的条件：1.诱导⑶8-阳性T细胞，如通过细胞毒性试验或干扰素（IFN)-Y分泌或穿孔素 的表达或颗粒酶B表达或可由CD8-阳性T细胞产生的其他细胞因子可检测到，其可通过酶 联免疫斑点（ELISpot)或细胞内细胞因子染色或细胞因子酶联免疫吸附试验（ELISA)或 其他等效方法测量作为上述背景。2.诱导⑶4-阳性T细胞，其可通过由ELISpot或细胞 内细胞因子染色或细胞因子ELISA或其他等效方法测量作为上述背景的细胞因子检测到。 细胞因子可包括IFN-a、IFN-γ、白细胞介素（IL)-2、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细 胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12、白细胞介素-13、白介素-17、肿瘤坏死因子 (TNF)-α、肿瘤坏死因子-β或其他可由CD4-阳性T细胞产生的细胞因子。3.诱导抗体， 其可以通过蛋白质印迹、ELISA和其他等效或相关的方法检测。4.诱导不被如在1和2中 所述的CD8-阳性T细胞或CD4-阳性T细胞介导的任何类型的细胞免疫应答。
[0037] 变体的特征在于氨基酸缺失、替换、和/或添加。优选地，氨基酸差异是由于一 个或多个保守氨基酸替换。术语"保守氨基酸替换"涉及脂肪族的或疏水性氨基酸丙氨酸 (Ala)、缬氨酸（Val)、亮氨酸（Leu)和异亮氨酸（lie)的替代；羟基残基丝氨酸（Ser)和苏 氨酸（Thr)的替换；酸性残基天冬氨酸（Asp)和谷氨酸（Glu)的替换；酰胺残基天冬酰胺 (Asn)和谷氨酰胺（Gln)的替换；碱性残基赖氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)和组氨酸（His)的 替换；芳香残基苯丙氨酸（Phe)、酪氨酸（Tyr)和色氨酸（Trp)的替换；和小型氨基酸丙氨 酸（Ala)、丝氨酸（Ser)、苏氨酸（Thr)、甲硫氨酸（Met)、和甘氨酸（Gly)的替换。
[0038] 为了生成对于FSP具有一定程度的同源性的多肽，例如可利用基因工程以在克隆 的DNA序列的特定位置处引入氨基酸变化，进而识别肽功能的关键区域。例如，可以使用定 点诱变或丙氨酸扫描诱变（在分子中的每个残基处引入单一丙氨酸突变）（Cunningham和 Wells，1989年）。由此产生的突变分子可以使用实施例1的测试来测定免疫原性。
[0039] 优选地，变体的特征在于不超过8个氨基酸（aa)，更优选地不多于6个氨基酸，和 甚至更优选地不多于4个氨基酸的替换、删除和/或添加。
[0040] 在FSP片段中，特定的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、最好至少10个连续氨 基酸、更优选至少连续15个氨基酸，甚至最好是至少20个连续氨基酸被剩留（left)。该片 段仍能引发免疫应答。
[0041] 在更优选的实施方式中，本发明的疫苗另外包括佐剂和/或免疫刺激的细胞因子 和趋化因子。
[0042] 合适的佐剂包括铝盐，如氢氧化铝凝胶（明矾）或磷酸铝，但也可是钙盐、铁盐或 锌盐，或者可以是酰化酪氨酸或酰化糖、阳离子化或阴离子化衍生多糖或聚磷腈的不溶悬 浮液。其他已知佐剂包括含胞嘧啶鸟嘌呤（CpG)的寡核苷酸。寡核苷酸的特征在于胞嘧啶 鸟嘌呤二核苷酸是非甲基化的。这种寡核苷酸是众所周知的且例如在WO 96/02555中所 不O
[0043] 免疫刺激的细胞因子的使用已成为肿瘤免疫治疗中越来越有前景的方法。主要目 标是激活肿瘤特异性T淋巴细胞，其能够使肿瘤细胞远离具有低肿瘤水平的患者，或防止 患者疾病复发。在抗原位点局部提供高水平的免疫刺激细胞因子的策略已经证实了临床 前疗效和临床疗效。优选的免疫刺激细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、干扰素、粒细 胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF)和TNF-α。
[0044] 趋化因子是小型的（7_16kD)、分泌的和结构上相关的可溶性蛋白，其涉及白细胞 和树突状细胞趋化性、多形核白细胞（PMN)脱颗粒和血管形成。趋化因子在宿主对损伤、过 敏原、抗原或入侵微生物应答的初始阶段期间产生。趋化因子有选择性地吸引白细胞到炎 症病灶，诱导细胞迀移和活化。趋化因子可增强先天的或特定的宿主抗肿瘤免疫性，因而也 可用于与FSP结合。
[0045] 本发明的疫苗还可包含编码用于DNA免疫的FSP的核酸，DN