从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法
【专利说明】从含二硫化物的蛋白质制备缀合物的方法
【背景技术】
[0001] 已将各种各样的化学部分（"有效载荷（payloads) "）共价连接到酶、抗体、以及其 它大的多肽或蛋白质中，以形成缀合物（conjugates)。有效载荷可用来定位它们所连接的 蛋白质（例如，标签）、修饰蛋白质的物理化学性质或稳定性（例如，聚乙二醇化）、使蛋白 质连接到另一分子或蛋白质（用于连接缀合物至另一化合物或另一缀合物的偶联基团）、 或修饰有效载荷或蛋白质的功能或活性（例如，疫苗缀合物）。蛋白质也可作为载体来递送 所连接的有效载荷至特定组织或细胞类型中，例如在抗体-药物缀合物（ADC)中。可以有 用地连接至蛋白质的有效载荷的类别包括可检测部分（标签）、使蛋白质连接到表面或另 一化合物的销定部分（moieties)、与蛋白缀合时引起免疫应答的抗原、与化学互补缀合偶 联配偶体很容易反应（因此连接蛋白至另一实体）的偶联基团、以及治疗性部分如细胞毒 素和其它生物活性剂。以受控和可重复的方式将这些不同的结构连接在蛋白质上对于缀合 物正确地发挥其功能是很关键的。因此，需要有将许多类型的有效载荷连接到许多不同的 蛋白质或多肽上的各种方法。
[0002] 已经开发了用于将有效载荷连接至蛋白质以形成蛋白质缀合物的许多方法。 例如，见 Sletten，E.M.和 Bertozzi，C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6974 - 6998; Basle '，Ε· ;Joubert，N.;和 Pucheault，M.Chemistry&Biology 2010,17,213-227。在 一些蛋白质缀合物中，连接蛋白质和有效载荷的方法可能对缀合物的活性或相关的性质 具有检测不到的影响；在其他情况下，蛋白质和有效载荷之间的连接子（linkage)的性质 可能显著影响缀合物的活性或性质。有时候，例如控制每蛋白质的有效载荷部分的数目， 或控制有效载荷连接的精确位置从而使得它们不会干扰蛋白质功能，是很重要的。例如， ADC需要蛋白质识别并结合到靶细胞的表面结构上以赋予选择性，所以有效载荷的定位 一定不能干扰抗体结合其必须识别的表面结构（抗原）。例如，参见Expert Opin. Biol. Ther.2012, 12, 1191-1206 ;Toxins 2011,3,848-883;以及 Laurent Ducry Drug Delivery in Oncology:From Basic Research to Cancer Therapy,1st Edition. Wiley-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA. 2012, 12, 355-374.
[0003] 大多数用于将有效载荷连接至蛋白质的方法涉及在蛋白质和感兴趣的特定有效 载荷之间添加连接化学结构（连接体）。连接体利用每一部分上可利用的官能团，提供了将 感兴趣的有效载荷连接到蛋白质的方法。连接体通常使得有效载荷和蛋白质之间的距离能 够被调节，并且在释放有效载荷对于实现其目标很重要的情况下，还可以包括能够在体内 溶解或降解的可裂解部分，从而从蛋白质释放有效载荷。例如，在ADC中，在其可具有期望 效果的位置裂解并释放有效载荷，对于缀合物而言可能是很关键的。由于不同类型的蛋白 质-有效载荷缀合物对有效载荷和蛋白质连接的方式存在不同要求，因此对能一贯且有效 地将有效载荷连接到蛋白质的新方法存在持续的的需求。
[0004] 用于形成蛋白质缀合物的最常用的方法依赖于自然存在于许多天然蛋白质中的 某些氨基酸的化学反应性：经常使用赖氨酸和半胱氨酸，因为它们提供了将有效载荷连接 至蛋白质的反应性位点。赖氨酸具有游离胺基团，其可与连接基团或有效载荷上合适的亲 电性官能团反应，且半胱氨酸可以通过其游离巯基反应。然而，依靠这些天然存在的反应性 位点可能是复杂的：当所关注的蛋白质上有太多或太少所述特定类型氨基酸时，例如，在蛋 白质上得到恰好"载量"的有效载荷变得困难。蛋白表面的高丰度的赖氨酸使得位点和区 域选择性缀合变得困难，并导致异质的产物。相反，半胱氨酸是比较罕见的，而且主要以二 硫化物连接对存在于蛋白质中。半胱氨酸处的缀合通常需要还原二硫化物，接着与缀合试 剂（例如马来酰亚胺）反应，分别标记个体半胱氨酸。因为这消除了二硫键，因此蛋白质结 构和稳定性可能会被该方法破坏。
[0005] 蛋白质还经常具有比要连接的有效载荷的最佳数目更多的赖氨酸：加入足够的有 效载荷部分来占据所有可利用的赖氨酸，以确保一致、均匀的产物，这可能会添加对于最佳 疗效而言过多的有效载荷分子。这可通过仅使用赖氨酸中的一些用于缀合来避免，但这样 的部分或不完全负载一般将提供异质产品，这可能会由于多种原因而产生问题，例如在第 一个商业化ADC，即Mylotarg?的情况下，ADC产物的异质性看来可能已经导致决定撤回该 产品登记的问题。Fuenmayor等，Cancers, vol. 3, 3370-93(2011)。另外，即使存在用于最 佳负载的足够的特定类型氨基酸基团（例如，赖氨酸），当蛋白质为其溶液构象时，所述特 定类型氨基酸基团中的一些或全部可能被"埋入"蛋白质内部，使它们不能有效地缀合，或 使它们可被"部分"地接近，这也可导致缀合物的异质性。因此，尽管赖氨酸是可用于缀合 的有用位点，但在很多情况下其是不理想的。
[0006] 天然蛋白质中半胱氨酸存在的频率比赖氨酸的低，并且当其以足够数量存在时， 半胱氨酸可能适合用作缀合位点；当存在太少半胱氨酸时，可通过标准蛋白修饰方法插入 一个或多个。然而，避免通过插入半胱氨酸修饰天然蛋白质序列通常是优选的；此外，天然 蛋白质中表面可接近的半胱氨酸通常位于其他半胱氨酸附近以形成二硫化物，其对于维持 蛋白质的活性构象可能是很重要的。虽然通过还原二硫化物使该二硫化物转变成两个游离 半胱氨酸并不困难，但这样做可能会破坏蛋白质的二级或三级结构。
[0007] 已经报道了试图在通过还原蛋白质中的二硫化物形成的半胱氨酸残基之间插 入连接臂（tether)的一些方法。一个这样的方法涉及砜取代的甲基丙烯酸酯衍生物。 US2006/0210526。该方法形成反应性中间体，其在环化之前需要一消除步骤，并且用于该 多步骤方法的条件可能会导致半胱氨酸之间连接体（连接臂）的不完全形成，并且这些反 应条件甚至可导致蛋白质变性。另一方法使用马来酰亚胺衍生物。W02011/018613。然 而，该方法形成的缀合物存在稳定性问题，因为马来酰亚胺上的硫醇的Michael加成是可 逆的。因此，需要有缀合化学部分至含二硫键的蛋白质以形成蛋白质缀合物的改进的方 法。特别是，需要这样的方法，其使用二硫化物组件（巯基），而不放弃二硫化物的构象控 制效果，同时还提供高效的缀合、稳定性和一致的有效载荷/蛋白质比。此外，还需要使 蛋白质保持特定构象的固定（stapling)方法(例如参见，Expert Opin. DruR Discov. (2011)6(9) :937-963 ：Tetrahedron 55 (1999) 11711-11743)，其还提供使使该固定的蛋白 质与有效载荷缀合的方法。本发明提供了这样的方法。
[0008] 发明概述
[0009] 在一个方面，本发明提供了一种方法，其使用在蛋白质表面形成二硫化物的两个 半胱氨酸残基将有效载荷链接到蛋白质，形成蛋白质缀合物。该方法包括还原二硫化物， 以提供两个游离的硫羟基，并使用连接臂将这两个硫羟基系在一起，所述连接臂使它们保 持在与它们形成二硫化物时所占据的大致相同的位置。保持半胱氨酸基团在它们大致相 同的位置最小化二硫化物还原时可能发生的对蛋白质构象的任何不利影响。被引入将两 个硫羟基连接在一起的连接臂含有可用于连接所关注的有效载荷的反应性官能团。在一 些实施方案中，连接臂含有羰基，所述羰基具有与外部胺基团形成亚胺或肟或腙键的足够 反应性，并且通过形成这样的键将有效载荷缀合到活化的蛋白质上。例如，还原的蛋白质 可以与1，3-二卤代丙酮如二氯丙酮或二溴丙酮反应，由此插入将两个硫原子连接在一起 的3-碳连接臂。这可适当地模拟二硫化物的效果，即，将蛋白质保持在与二硫化物存在时 具有的构象非常相似的构象，同时它还提供了比二硫化物更好的稳定性以及连接有效载荷 的位置。在本发明方法和组合物中所用的连接臂提供了化学反应性官能团，且在两个半胱 氨酸硫原子之间含有这一类型连接臂的蛋白质在本文中称为活化的蛋白质。有效载荷可以 使用连接臂上的官能团连接到活化的蛋白质上。例如，通过蛋白质的硫醇与二卤代丙酮反 应形成的连接臂提供作为用于缀合的位点的羰基。含有合适胺优选氨氧基或肼的有效载 荷（胺化的有效载荷），可以通过在有效载荷的胺官能团和连接臂的羰基（酮）之间形成 Schiff碱，从而很容易地缀合至这样的活化的蛋白质上。如果有效载荷分子包含适当的反 应性-NH2基团，该方法可使用未修饰的有效载荷分子，如果需要的话，可通过常规方法将反 应性胺如-ONH 2连接至有效载荷