TAT - Cygb组
[0037]图8各组小鼠肝脏Masson三色染色(40倍)
[0038]其中:(a)_正常组;(b)_刚造模完小鼠;(C)-模型组;(d)-低剂量TAT-Cygb组;(e)高剂量TAT-Cygb组
[0039]图9 TAT-Cygb融合蛋白对各组小鼠血清ALT和AST的影响
[0040]其中:1-刚造模完的小鼠；2_正常组；3_模型组；4_高剂量TAT-Cygb组；5_低剂量 TAT-Cygb 组；*p〈0.05vs 模型组；#p〈0.0lvs 模型组
[0041]图10 TAT-Cygb融合蛋白对各组小鼠血清HA、LN、C-111, C-1V的影响
[0042]其中:1-刚造模完的小鼠；2_正常组；3_模型组；4_高剂量TAT-Cygb组；5_低剂量 TAT-Cygb 组；*p〈0.05vs 模型组；#p〈0.0lvs 模型组
[0043]图11 TAT-Cygb融合蛋白对各组小鼠肝组织SOD、MDA、Hyp的影响
[0044]其中:1 -刚造模完的小鼠；2 -正常组；3 -模型组；4 -高剂量TAT - Cygb组；5 -低剂量TAT - Cygb组;*p〈0.05vs模型组;**p〈0.0lvs模型组
[0045]实施方案:
[0046]以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0047]《实施例1》重组Tat-Cygb抗炎症功能验证
[0048]按照专利号201010202986.2所述方法，制备重组融合Tat-Cygb蛋白。
[0049]I) 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验:将40只25g雌雄对半的KM小白鼠，按每组5只雄鼠和5只雌鼠，随机分为5组，分别为高剂量TAT-Cygb组、低剂量TAT-Cygb组、阳性对照组、模型组；
[0050]2)在每只小白鼠左耳廓内均匀涂30 μ L的二甲苯，引发急性的耳廓肿胀炎症，可见小白鼠左耳红肿胀大；
[0051]3) 30min后，给小白鼠左耳廓均匀涂药，对照组为右耳廓。高剂量TAT - Cygb组(500 μ g/只)，低剂量TAT -Cygb (100 μ g/只)，阳性对照组(地塞米松软膏)，模型组(生理盐水)；
[0052]4) Ih后，脱颈椎处死小鼠，用棉签轻擦去小白鼠左耳廓上残余的药，用眼科剪剪下左右耳;
[0053]5)用打孔器(直径8_)打下两只耳朵相同的部位，得到两个圆形耳片，分别置于分析天平上称重，记录。
[0054]结果显示，各实验组小鼠的耳廓肿胀率(图1)，通过模型组与各给药组的对比可以看出，各给药组均可不同程度地缓解小鼠的耳廓肿胀，高剂量TAT -Cygb组和地塞米松组与模型组相比，均具有显著性差异(P〈0.01)，其中高剂量TAT -Cygb的抗炎效果略逊色于地塞米松组，但二者之间无显著性差异(P>0.05)，而低剂量TAT-Cygb组小鼠的耳廓肿胀程度较地塞米松组和高剂量组高，与模型组相比无显著性差异(P〈0.05)。实验结果表明，低剂量的TAT - Cygb抗炎效果较弱，而高剂量的TAT - Cygb具有较好的抗炎效果。
[0055]《实施例2》皮肤创伤愈合动物模型验证
[0056]I)正常饲养10只(200g±20g)雄性KM大白鼠7d，开始造模；
[0057]2)腹腔注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉大鼠，该剂量可使大鼠维持昏迷状态2h ?3h ;
[0058]3)用眼科弯剪剪去大鼠背部的大部分毛，涂上适量脱毛膏；
[0059]4) 1min?15min后，用医用棉花擦去残余的脱毛膏和毛，再用温水擦干净，注意不要让大鼠受凉；
[0060]5)用75%酒精消毒大鼠背部皮肤，然后用直径12mm的圆形打孔器在大鼠背部均匀切6个相同的圆形创面，医用棉花止血，造模完成；
[0061]促进创伤愈合治疗:
[0062]I)在每次给药前腹腔注射3%戊巴比妥钠(15mg/kg)麻醉大鼠；
[0063]2)右前部创面为高剂量TAT - Cygb组，每天涂抹无菌TAT - Cygb (80 μ g/次)，一日两次；
[0064]3)左前部创面为低剂量TAT - Cygb组，每天涂抹无菌TAT - Cygb (30 μ g/次)，一日两次；
[0065]4)右中部创面为高剂量Cygb组，每天涂抹无菌TAT - Cygb (80 μ g/次)，一日两次；
[0066]5)左中部创面为低剂量Cygb组，每天涂抹无菌TAT - Cygb (30 μ g/次)，一日两次；
[0067]6)右后部创面为阳性对照组，每天涂抹红药水(10yL/次)，一日两次；
[0068]7)左后部创面为阴性对照组，每天涂抹无菌生理盐水(10yL/次)，一日两次。
[0069]8)每天观察伤口创面表皮肉芽组织的生长情况，以及上皮组织的生长愈合情况，并拍照记录。在给药后包上伤口敷料，避免感染。
[0070]皮肤组织切片的制备与染色:
[0071]给药15d后，取创伤愈合处皮肤组织固定，做皮肤组织石蜡切片，观察伤口愈合后疤痕组织的大小。
[0072]TAT - Cygb对大鼠皮肤创伤愈合的影响:
[0073]于正常条件下饲养KM大白鼠10只，7d后造模。利用12mm的皮肤打孔器在脱毛后的大鼠背部按顺序均匀打6个孔。分别代表高剂量TAT -Cygb组(160 μ g/d)、低剂量TAT -Cygb组(60 μ g/d)、高剂量Cygb组(160 μ g/d)、低剂量Cygb组(60 μ g/d)、阳性对照组(红药水，200 μ L/d)、阴性对照组(无菌生理盐水，200 μ L/d)(图2)。每天用药前，肉眼观察大鼠伤口创面表皮肉芽组织的成长情况，以及上皮组织的生长愈合速度，拍照记录。
[0074]通过每天用药后的跟踪观察可发现，各剂量的TAT - Cygb和Cygb组与红药水组、对照组的伤口创面修复程度与愈合方式有较显著的差别(图3)。造模第一天，各组创面差别不大，伤口面积大小相同，表面比较湿润；用药第四天，可见高低剂量的TAT - Cygb组、Cygb组以及红药水组的创面已长出肉芽组织，带少量渗出液，局部已经长出薄层或点状上皮，而对照组伤口已形成褐色结痂，这是由伤口表面的血液、坏死物质以及渗出液干燥后形成的；用药后第七天，伤口面积缩小，高低剂量的TAT - Cygb组和高剂量Cygb组伤口皮肤创缘明显收缩，肉芽组织生长完好，伤口红润，而低剂量Cygb组和红药水组伤口形成痂皮，与对照组相似，这种于痂下愈合的方式一般比无痂伤口愈合慢，虽然同样是在创缘增生表皮基底细胞，但其在痂下进行，必须在溶解部分痂皮后，才能不断由外围向创面中心移动再生表皮，直至表皮再生完成，痂皮才能脱落，因此这种愈合方式耗时较长；用药后第十天，伤口面积继续缩小，高低剂量TAT - Cygb组伤口趋于愈合，高剂量Cygb组伤口肉芽组织生长完好，低剂量Cygb组、红药水组和对照组仍有痂皮，部分再生表皮上的痂皮脱落。用药后第十三天，高低剂量TAT - Cygb组和高剂量Cygb组创面已愈合，但仍需要时日待表皮完全上皮化，低剂量Cygb组痂皮脱落，伤口肉芽组织生长完好，红药水组和对照组仍见小块痂皮，愈合程度欠佳。
[0075]实验结果表明，TAT - Cygb和Cygb均可促进伤口愈合，推测二者均因具有过氧化物酶活性而具有抗炎症作用，从而促进伤口愈合。此外，由于TAT -Cygb带有TAT穿膜肽的功能，能穿透皮肤细胞，在细胞内作用，促进皮肤细胞生长，因此效果较Cygb更明显。
[0076]正常皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成，真皮层中可见大量结蹄组织和皮肤附属器，如汗腺、皮脂腺和毛囊等。而全层皮肤切除的大鼠，其皮肤附属器被完全破坏，愈合过程中，肉芽组织增生，通过改建成熟后，形成由胶原纤维和弹性纤维组成的纤维结缔组织，即瘢痕组织。
[0077]将用药16d后的大鼠创伤皮肤组织切片，可观察每组大鼠创伤处瘢痕修复区域的大小。如(图4)所示，对照组B大鼠皮肤创伤处在100倍镜下的一个视野内仅能看到玻璃样变的瘢痕组织，周围的毛囊、汗腺和皮脂腺等皮肤附属器在视野之外；同样，红药水组C大鼠皮肤创伤由于痂下愈合较慢，一个视野内看不到正常皮肤构造；低剂量Cygb组D，在100倍镜的一个视野内已能看到部分皮肤附属器；高剂量Cygb组E、低剂量TAT - Cygb组F和高剂量TAT - Cygb组G可见周围的皮肤附属器向中心靠拢，瘢痕修复区域依次减小。推测TAT -Cygb和Cygb因其可改善细胞氧化应激，防止成纤维细胞过度增殖迀移和细胞外基质过度积聚，使得瘢痕组织比对照组和红药水组的小，另一反面，TAT - Cygb和Cygb均通过抗炎症作用促进创伤较快愈合，上皮形成较快，其中TAT -Cygb组比Cygb组效果更明显，而对照组和红药水组由于痂下愈合较慢，同时在愈合过程中大鼠的运动加剧了伤口的反复感染，使肉芽组织过度增生，导致瘢痕组织较大。
[0078]《实施例3》:Tat-Cygb融合蛋白治疗小鼠肝纤维化
[0079]肝纤维化小鼠模型的构建及治疗:
[0080]I)实验分组:模型组、TAT - Cygb高剂量组、TAT - Cygb低剂量组、正常组，每7只小白鼠一组，共28只小白鼠。