新的黏膜佐剂和递送系统的制作方法
【专利说明】新的黏膜佐剂和递送系统
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请要求提交日为2012年10月29日的美国临时专利申请号61/719, 713 的优先权的权益，其以全文引用并入本文。
【背景技术】
[0003] 佐剂是改变其它试剂例如药物或疫苗效果的药理学或免疫学试剂。佐剂通常包含 在疫苗中以增强受体对所提供的抗原的免疫应答，同时将注入的异物保持在最低限度。
[0004] 佐剂自身并不赋予免疫性。佐剂可以以不同方式作用以提呈抗原至免疫系统。佐 剂可以作为抗原的仓库（depot)，在很长一段时间内提呈抗原，从而在身体清除抗原之前使 免疫应答最大化。仓库型佐剂的实例是油乳化剂，如弗氏佐剂。佐剂也可以作为导致身体 招募并扩大其免疫应答的刺激物。例如，含有每种靶细菌所产生的微量毒素的破伤风、白喉 和百日咳疫苗还含有氢氧化铝。铝盐是美国销售疫苗中的常见佐剂，而且在疫苗中已经使 用超过70年。
[0005] 壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺（脱乙酰化单元）和N-乙酰 基-D-葡糖胺（乙酰化单元）组成的线性多糖。它通过用碱性氢氧化钠处理虾和其它甲壳 类壳制成。壳聚糖在用作口服和皮下疫苗载体上取得一些成功。在这里，我们提供新的基 于壳聚糖的佐剂制剂，已证明其作为佐剂比传统使用的明矾佐剂表现更佳。具体地，本文提 供的基于壳聚糖的佐剂有效刺激IgA应答。
【发明内容】
[0006] 本文提供佐剂、包含所述佐剂的疫苗制剂、制备所述佐剂的方法以及使用所述佐 剂和疫苗制剂的方法。具体地，壳聚糖和抗原可以通过使用醛进行交联。在一方面，提供包 含0.5%至2%的醛交联的壳聚糖以及抗原的组合物。在疫苗组合物中醛的终浓度不高于 0· 5%〇
[0007] 在另一方面，提供佐剂组合物，其包括连接至壳聚糖的碳水化合物以形成希夫碱。 所述佐剂可以与抗原组合。所述碳水化合物可以是甘露糖。
[0008] 在又一方面，提供疫苗制剂。疫苗制剂可包括本文提供的佐剂和抗原。所述抗原 可以是蛋白或自然中的微生物，合适的微生物包括细菌、酵母、或其它真菌、真核寄生虫以 及病毒，其可被减毒、重组、失活（killed)或者灭活（inactivated)。
[0009] 在还一方面，本文提供制备佐剂和疫苗组合物的方法。在乙酸溶液中溶解壳聚糖 以及添加抗原至溶解的壳聚糖。最后，使用醛将抗原和壳聚糖组合起来以使醛的终浓度在 0. 02%和0. 5%之间。可向佐剂加入Tris来淬灭游离醛以产生更稳定的佐剂。
[0010] 在再一方面，还提供增强受试者对抗原免疫应答的方法。所述方法包括向受试者 施用本文所公开的包含抗原和基于壳聚糖的佐剂的疫苗制剂。所述基于壳聚糖的佐剂可以 是醛交联的壳聚糖或碳水化合物连接的壳聚糖。
【附图说明】
[0011] 图1显示在使用所述疫苗佐剂制剂初次接种疫苗以及加强后在火鸡中的抗β -半 乳糖苷酶IgG抗体应答。不同的字母表示显著性差异（Ρ < 0. 05)。
[0012] 图2显示在使用所述疫苗佐剂制剂初次接种疫苗以及加强后在火鸡中的败血 梭状芽胞杆菌（Clostridium septicum) IgG抗体应答。不同的字母表示显著性差异 (p < 0· 05) 〇
[0013] 图3是一组图，其显示在使用所述芽孢杆菌属（Bacillus)载体的禽流感疫苗佐剂 制剂进行接种疫苗和加强之后在各个时间点上在鸡中的IgG(图3A)和IgA(图3B)抗体应 答。
[0014] 图4显示在使用所述疫苗佐剂制剂初次接种疫苗以及加强后使用竞争性ELISA 测量的针对沙门氏菌属（Salmonella)的IgG抗体水平。不同的字母表示显著性差异 (p < 0· 05) 〇
[0015] 图5显示在使用所述疫苗佐剂制剂初次接种疫苗以及加强后使用竞争性ELISA测 量的针对沙门氏菌属的IgA抗体水平。不同的字母表示显著性差异（p< 0.05)。
[0016] 图6是一组图，其显示在使用所述疫苗佐剂制剂初次接种疫苗以及加强后使用竞 争性ELISA测量的针对沙门氏菌属的IgG(图6A)和IgA(图6B)抗体水平。不同的字母表 示显著性差异（P < 0. 05)。
[0017] 图7显示在初次接种疫苗之后第22天（攻击后第3天）在肝和脾（L/S)或盲肠 扁桃体（CT)中的沙门氏菌属的复原（recovery)百分比。接种疫苗操作规程与图6所用相 同，以及*表示P < 0. 05。
[0018] 图8显示在用所述疫苗佐剂制剂经由所述施用途径初次接种疫苗以及加强（第12 天）之后第22天，使用竞争性ELISA测量的针对沙门氏菌属的IgA抗体水平。不同的字母 表示显著性差异（P < 0. 05)。
[0019] 图9显示使用所述疫苗佐剂制剂对雏鸡进行接种疫苗之后，通过竞争性ELISA测 量的针对沙门氏菌属的IgG免疫应答。不同的字母表示显著性差异（p < 0. 05)。
[0020] 图10显示使用所述疫苗佐剂制剂对雏鸡进行接种疫苗之后，通过竞争性ELISA测 量的针对沙门氏菌属的IgA免疫应答。不同的字母表示显著性差异（p < 0. 05)。
[0021] 图11显示使用所述疫苗佐剂制剂对火鸡进行单次肠胃外接种疫苗之后，针 对鸟博德特氏菌（Bordetella avium)的IgG免疫应答。不同的字母表示显著性差异 (p < 0· 05) 〇
[0022] 图12显示使用所述疫苗佐剂制剂对孵化当日的火鸡进皮下接种疫苗之后，接着 在第14天通过饮用水施用相同疫苗佐剂组合之后，针对鸟博德特氏菌的IgG免疫应答。在 第21天测量应答。不同的字母表示显著性差异（p < 0. 05)。
【具体实施方式】
[0023] 本文提供包含壳聚糖的佐剂、包含所述佐剂的疫苗制剂、制备所述佐剂的方法以 及使用所述佐剂和疫苗制剂的方法。总之，本文描述一种新颖的佐剂系统，其可以以与其 它佐剂（如用于肠胃外（注射）的那些）类似的方法使用。基底分子包括壳聚糖，其是几 丁质的脱乙酰形式，是许多无脊椎动物（虾、蟹、昆虫等）的外骨骼。壳聚糖视为公认安全 (GRAS)的化合物，用于减轻体重、降低胆固醇、失眠和肾功能改善。壳聚糖也用作佐剂与各 种黏膜疫苗一起使用（Jabbal-Gill等人，2012)，但是如实施例所示，本文所述的壳聚糖是 新的而且比传统壳聚糖功能更佳。
[0024] 交联甲醛的壳聚糖-蛋白质和碳水化合物连接的壳聚糖提供用于疫苗抗原口服 或肠胃外递送的独特佐剂。壳聚糖已用作口服和皮下疫苗的载体。在一些制剂中，通过甲醛 处理将抗原共价结合到壳聚糖。在其它情况下，通过加入连接到壳聚糖的碳水化合物（甘 露糖、岩藻糖和半乳糖）来改进佐剂系统，以使得靶向抗原提呈细胞上的甘露糖受体上，从 而增强针对壳聚糖-抗原复合物的免疫应答。与灭活疫苗不同的是，无论是交联甲醛的壳 聚糖-蛋白质还是甘露糖化的壳聚糖蛋白复合物通过肠胃外和口服（或其它黏膜）递送途 径都能给出稳健的免疫应答。
[0025] 在一方面，提供佐剂组合物，其包含连接到壳聚糖的碳水化合物连以形成希夫碱。 所述佐剂可与抗原组合。所述碳水化合物可以是甘露糖、甘露二糖、葡萄糖、半乳糖或果糖。 也可以使用其它合适的碳水化合物。不局限于理论，将所述碳水化合物添加到壳聚糖是为 了将壳聚糖靶向抗原提呈细胞的表面上针对这些碳水化合物的受体。
[0026] 在以下实施例中更全面地描述制备本文所用的碳水化合物壳聚糖。我们的方法是 根据JayasreeQayasree等人，2011)的使用具有可用羰基的开环碳水化合物，所述羰基与 壳聚糖上的氨基反应形成希夫碱。通过使用氰基硼氢化钠（NaCNBH4)还原可以稳定所述希 夫碱。在图6中还原形式的壳聚糖（Man-C VI)与非还原形式的壳聚糖（Man-C V2)相比较， 我们证明还原对免疫增强是非必须的。非还原形式产生最佳的IgA应答，因而两种形式都 可以使用。此外，非还原形式的甘露糖化的壳聚糖不需要添加有毒化学物（NaCNBH4)。简言 之，将碳水化合物（合适地为