. 1 μ M地塞米松+IOmM烟碱酰胺+50 μ g/ml β -巯基乙醇+2mM L-谷氨酰 胺+5mM Hepes)。根据条件，在共培养开始时添加20ng/ml的EGF和/或50ng/ml的HGF。 而且，作为对照，在没有aHSC的状态下同样地仅培养肝干细胞。
[0174] 在共培养第9天，用针对作为肝细胞标记物的白蛋白的抗体（兔多克隆、MP Biomedicals)进行免疫染色，使用倒置显微镜（Nikon)以100倍的倍率拍摄GFP/白蛋 白两阳性群落，根据所得的图像对GFP/白蛋白两阳性群落的数量进行计数，并且使用 NIS-Elements software(Nikon)算出面积（图 15 ~18) 〇
[0175] (3)干细胞与星状细胞的非接触共培养
[0176] 在细胞培养小室（孔径为 0.4 μπκ BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)上以 5X104个/孔的密度接种上述（I)中所得的aHSC，在培养箱内在37°C、5% CO2下使用 DMEM+10 % FBS培养48小时。在aHSC接种的2天后，在放有用I型胶原被覆的盖玻片 (IWAKI，Tokyo, Japan)的24孔板（BD Falcon)中，以IX IO4个/孔的密度接种上述（1) 中所得的肝干细胞。接着，将包含aHSC的所述细胞培养小室插入至24孔板的孔中，在培 养箱内在37°0、5%〇)2下共培养10天（作为培养基，使用DME/F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F_12Ham)+10% FBS+ITS(10mg/l 膜岛素、5. 5mg/l 转铁蛋白、 0. 67 μ g/1硒）+0. 1 μ M地塞米松+IOmM烟碱酰胺+50 μ g/ml β -巯基乙醇+2mM L-谷氨酰 胺+5mM Hepes)。而且，作为对照，在没有aHSC的状态下同样地仅培养肝干细胞。
[0177] 在共培养第10天用抗白蛋白抗体（兔多克隆、MP Biomedicals)进行免疫染色， 使用倒置显微镜（Nikon)以100倍的倍率拍摄白蛋白阳性群落，根据所得的图像，使用 NIS-Elements software(Nikon)算出白蛋白阳性群落的面积（图19)。
[0178] 在另外的实验中，在共培养第10天使用Premix WST-lCell Proliferation Assay System(Takara, Tokyo, Japan)，使用酶标仪（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)进 行细胞增殖的测定（图20)。
[0179] (4)结果
[0180] 根据图15~18所示的接触共培养实验的结果可知，通过将肝干细胞与活性型肝 星状细胞共培养，发生了肝干细胞向肝细胞的分化和增殖。而且可知，肝干细胞向肝细胞的 分化和增殖通过添加 EGF和HGF而得到显著地促进。
[0181] 根据图19和图20所示的非接触共培养实验的结果可知，活性型肝星状细胞即使 在不与肝干细胞接触的状态下也可以诱导肝干细胞向肝细胞的分化和增殖。
[0182] 这些结果表示由活性型肝星状细胞分泌的液性因子会诱导肝干细胞向肝细胞的 分化和增殖。
[0183] 例6肝部分切除后的肝组织中的DNA合成的经时夺化
[0184] (I)BrdU阳性细胞的经时变化
[0185] 以与例2相同的方式制作肝部分切除大鼠。为了调查肝部分切除后的肝脏内的 DNA合成的经时变化，以100 μ g/g体重的浓度对大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU投予后第 3小时采集肝脏组织。所采集的肝脏组织用10%福尔马林固定，并进行石蜡包埋。经石蜡 包埋的肝脏组织切成5 μ m厚的切片，使用IOmM柠檬酸缓冲液，在120°C下进行20分钟活化 后，使用5%山羊血清进行封闭。封闭后，使小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)在37°C下反应 60分钟。用PBS洗绦切片后，使Alexa488标记山羊抗小鼠 IgG(Invitrogen)在37°C下反 应60分钟。用PBS洗涤后，使用包含DAPI的封片剂进行封片，观察肝脏组织内的BrdU的 并入。将结果示于图21。
[0186] 为了测定在大鼠肝部分切除后的肝组织内进行DNA合成的细胞的比例，以 100 μ g/g体重的浓度对实施了肝部分切除的大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU投予后第3小 时，从门静脉灌流0.03%胶原酶溶液后，采集肝脏组织进行切碎而获得细胞混悬液。用包含 0. 25% BSA的Hanks溶液（Invitrogen)，以细胞浓度达到I X IO7个/100 μ 1的方式调整该 细胞混悬液，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体（BioLegends)，在37°C下反应60分钟。 反应结束后，使用流式细胞仪，测量BrdU阳性细胞数量。将结果示于图22。图中，大鼠肝部 分切除后的肝脏内的BrdU阳性细胞的比例是以将BrdU阳性细胞数量除以用流式细胞仪解 析的全部细胞数量而得到的值来表示。
[0187] 根据图21和图22所示的结果可知，在肝部分切除后，肝组织内的DNA合成呈现二 峰性增加。即，在切除的1天后出现第一个峰值，在2天后稍稳定，但在3天后再次增加，在 4天后以后缓慢降下来。
[0188] (2) BrdU阳性肝细胞的经时变化
[0189] 以与例2相同的方式制作肝部分切除大鼠。为了调查肝部分切除后的肝脏内的肝 细胞中的DNA合成的经时变化，以100 μ g/g体重的浓度对大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU 投予后第3小时采集肝脏组织。所采集的肝脏组织用10%福尔马林固定，并进行石蜡包埋。 经石蜡包埋的肝脏组织切成5 μ m厚的切片，使用IOmM柠檬酸缓冲液，在120°C下进行20 分钟活化后，使用5%山羊血清进行封闭。在封闭后，使APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体 (BioLegends)和山羊抗HNF4a抗体（Santa Cruz)在37°C下反应60分钟。用PBS洗绦切 片后，使Alexa488标记羊抗山羊IgG(Invitrogen)在37°C下反应60分钟。用PBS洗绦后， 使用包含DAPI的封片剂进行封片，观察肝脏组织内的肝细胞的BrdU的并入。将结果示于 图23。
[0190] 为了测定在大鼠肝部分切除后的肝组织内进行DNA合成的肝细胞的比例，以 100 μ g/g体重的浓度对实施了肝部分切除的大鼠腹腔内注射BrdU。在BrdU投予后第3 小时，从门静脉灌流〇. 03%胶原酶溶液后，采集肝脏组织进行切碎而获得细胞混悬液。用 包含0· 25 % BSA的Hanks溶液（Invitrogen)，以细胞浓度达到I X IO7个/100 μ 1的方式 调整该细胞混悬液，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体（BioLegends)和山羊抗HNF4 α 抗体（Santa Cruz)，在37 °C下反应60分钟。用PBS洗绦后，使Alexa488标记羊抗山羊 IgG(Invitrogen)在37°C下反应60分钟。反应结束后，使用流式细胞仪，测量BrdU阳性 HNF4a阳性细胞数量。将结果表示于图24。图中，大鼠肝部分切除后的肝脏内的BrdU阳 性肝细胞的比例是以将BrdU阳性肝细胞数量除以用流式细胞仪解析的全部肝细胞数量而 得到的值表示。
[0191] 根据图23和图24所示的结果可知，肝细胞的增殖在肝部分切除的1天后出现峰 值后缓慢减少。包含肝细胞的肝脏中所存在的全部细胞的增殖如图21和图22所示，在肝 部分切除的1天后与3天后出现2个峰值，结果认为，1天后的第一个峰是由肝细胞的增殖 为主体引起的，3天后的第2个峰值是由肝细胞以外的细胞、例如干细胞等的增殖引起的。
[0192] 例7星状细朐对肝细朐的增葙的参与
[0193] (1)肝细胞与星状细胞的共培养
[0194] 为了评价星状细胞对肝细胞的增殖的影响，进行肝细胞与星状细胞的共培养。在 60mm培养皿中以IX IO5个的浓度接种例5中所得的aHSC，使用添加了 10% FBS的DMEM， 在37°C、5% CO2下培养24小时。在培养第24小时除去培养基，添加 Opti-MEM I reducing medium(Invitrogen)，在siRNA的转染的准备完成之前进行预培养。以最终浓度达到IOnM 的方式将siRNA与RNAiMX (Invitrogen)混合，在室温下静置15分钟而获得siRNA复合体。 所使用的siRNA如以下所述。
[0195] GFP siRNA(Ambion、Silencer GFP siRNA、Cat. No. AM4626)
[0196] Scramble siRNA :例 I 中所记载者
[0197] gp46siRNA :例1中所记载者
[0198] 在经预培养的aHSC中添加 siRNA复合体，在37°C、5% CO2下培养5小时。在培养 第5小时，将培养基更换为添加了 10% FBS的DMEM，在37°C、5% CO2下培养48小时。在培 养第48小时，除去培养基，添加 Opti-MEM I reducing medium，在siRNA的转染的准备完 成之前进行预培养。以最终浓度达到IOnM的方式将siRNA (GFP siRNA、Scramble siRNA、 gp46siRNA)与RNAiMAX混合，在室温下静置15分钟。在经预培养的aHSC中添加 siRNA复 合体，在37°C、5% CO2下培养5小时。在培养第5小时除去培养基，用PBS洗涤后，使用胰 蛋白酶-EDTA溶液回收HSC。
[0199] 对事先从GFP转基因大鼠肝脏采集、在用胶原I被覆的35mm培养皿中以5X IO4个的浓度接种的肝细胞，以5X104个/培养皿的浓度添加所回收的HSC，在37°C、5% 0)2下 培养48小时。在培养第48小时，将培养基更换为包含IOmM BrdU和10% FBS的DME/F12 培养基，在37°C、5% 0)2下再培养24小时。在培养第24小时除去培养基，用PBS洗涤后， 添加4% PFA，在室温下固定30分钟。在固定后用PBS洗涤，添加包含0.2N HCl和0.1% Triton X-100的PBS进行透过处理。
[0200] (2)焚光显微镜下的观察
[0201] 用PBS将上述（1)中进行了透过处理的细胞洗涤后，用5%山羊血清进行封闭， 添加小鼠单克隆抗BrdU抗体（MBL)和兔多克隆抗GFP抗体（Invitrogen)在37°C下进 行60分钟的一次抗体反应。在一次抗体反应后用PBS洗绦，添加 Alexa488标记山羊抗兔 IgG (Invitrogen)和Alexa555标记山羊抗小鼠 IgG (Invitrogen)，在37°C下进行60分钟的 二次抗体反应。在二次抗体反应后用PBS洗涤，使用包含DAPI的封片剂将细胞进行封片。 将荧光显微镜像示于图25。
[0202] ⑶ FACS 解析
[0203] 为了测定BrdU阳性GFP阳性肝细胞的比例，用PBS将上述（1)中进行了透过处理 的细胞洗涤后，添加 APC标记小鼠单克隆抗BrdU抗体和FITC标记兔多克隆抗GFP抗体，在 37°C下进行60分钟的抗体反应。在抗体反应结束后用PBS洗涤细胞，通过FACS解析测定 BrdU阳性GFP阳性肝细胞的比例。将结果示于图26。BrdU阳性细胞的比例是以将BrdU阳 性细胞数量除以用流式细胞仪解析的全部细胞数量而得到的值表示。
[0204] 根据图25和图26所示的结果可知，将肝细胞与aHSC共培养时，与单独培养肝细 胞时相比，肝细胞的增殖提高，但使gp46siRNA作用于aHSC时，该效果被抑制。这些结果表 示aHSC参与了肝细胞的增殖。
[0205] 例8实施了各种处理的胶原对肝细朐的增葙诰成的影晌 [0206] (1)在实施了各种处理的胶原上的肝细胞的培养
[0207] 以10 μ g/cm2的浓度在60mm培养皿中被覆来自大鼠尾的胶原I (Sigma)。变性胶 原I是将来自大鼠尾的胶原I在60°C下进行30分钟处理，以10 μ g/cm2的浓度被覆在60mm 培养皿中。MMP14处理胶原I是使用包含活性型MMP14(R&D System)的反应液（0.1 μg/ml 膜蛋白酶 3(Recombinant Human Active Trypsin3、R&D systems、Cat. No. 3714_SE)、50mM Tris、0.15M NaCl、10m