这一理论，以前胚胎微环境诱导诱导分化的实验结果，都可以解释了。然而，直接接触并不是必需的，肯定有一些种属间保守的分泌因子介导了这一诱导效应。这些因子应该是一群干细胞顺序产生的多个基因产物，随着发育阶段依次分泌的。弄清阻滞肿瘤细胞所对应的因子，就为这一肿瘤细胞诱导分化策略的临床应用提供了基础。由于这一诱导作用是同源同步的，在临床治疗上，应该是细胞类型特异的个体化治疗。
[0035]所谓的胚胎微环境的生物学本质是，与肿瘤细胞组织起源相同的、处在同一发育阶段的正常干细胞的微环境。而干细胞除了胚胎以外，也一直存在于我们体内，如骨髓。根据我的理论，不能进行手术切除的分散存在的肿瘤，例如白血病，将会更易治愈，这是由于它们易于被诱导，而骨髓造血干细胞在临床实践中也很易得到。骨髓造血干细胞应该被先诱导到与白血病细胞匹配的发育阶段，再移植到体内，可增加成功率。由于肿瘤细胞的诱导分化是由干细胞分泌的因子介导的，在诱导肿瘤细胞分化中，移植同源同步的干细胞和/或匹配的因子的效果是相当的。
[0036]为了验证我的理论，进行了系统的实验，使用不同种属，鸡和小鼠的相同组织来源和同一发育阶段的胚胎，来诱导人肝癌细胞H印G2分化和抑制体内瘤的生长。
[0037]1.使用不同发育阶段鸡胚的胎体和胚肝提取液，处理肝癌细胞H印G2，结果发现9-lld鸡胚肝提取物可显著抑制HepG2的增殖，并诱导细胞的成熟死亡。
[0038]2.使用不同发育阶段鼠胚的胚肝细胞，与肝癌细胞H印G2共培养，结果发现13.5-14.5d胚肝细胞可显著抑制!fepG2的增殖，并诱导细胞的成熟死亡。
[0039]3.使用13.5d鼠胚的胚肝细胞培养液，局部注射H印G2的裸鼠种植瘤，结果发现胚肝细胞培养液可使瘤块逐渐缩小，并最终消失，且停药后，无反复。
[0040]所述细胞可以来自人胚胎、动物胚胎，例如但不限于哺乳动物、禽类、或其组合。所述细胞还可以来自干细胞或祖细胞包括，例如，但不限于胚胎干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、组织内的干细胞或祖细胞。
[0041]在本发明的另一方面，在分离后，细胞可以通过数次传代培养，形成适于建立主细胞库的细胞数量，可以被收藏，低温保存。随后被培养，以使细胞数量增加到适于应用的水平。涉及细胞和细胞接触材料的环境暴露的操作，是以无菌操作方式进行的，以减少可能的外来材料或不期望的微生物的污染。来自主细胞库冻存管的细胞可以被解冻，并经过传代(通常是两次或更多次传代)培养。使细胞扩增到工作细胞数目阶段。培养的细胞直接用于制备抑制癌细胞生长或增殖的药物，或者获得细胞提取物后用于制备抑制癌细胞生长或增殖的药物，或者将培养的细胞与提取物组合后制得药物输入体内。
[0042]本文所用，“细胞提取物”包括可溶的组分和不可溶的组分或两者的混合。不可溶的组分包括分泌的那些胞外基质蛋白和生物组分。可溶的组分指这样的培养基:在其中细胞被培养并且分泌活性剂(一种或多种)到其中，包括没有沉积的蛋白质和生物成分。两种组分都可以被收集，并且任选地被进一步加工，在如本文所述的多种应用中单独或组合使用。
[0043]可溶的组分可以浓缩或稀释以获得最佳浓度。可溶的组分可以根据分子量进一步分离(例如，通过透析、过滤或层析)，以便组分中大多数溶质分子满足特定的分子量界限值。应当认识到，界限值不是绝对的，而是给定组分中所含的大多数溶质分子(例如，70%、80%、90%或95% )满足分子量界限值。因此，在本文提供的方法的某些实施方式中，细胞提取物可以包括可溶性组分，其中所含的溶质分子的70 %、或80 %、或90 %的具有小于5000道尔顿、或小于10000道尔顿、或小于30000道尔顿、或小于100000道尔顿的分子量。在另一些实施方式中，细胞提取物可以包括可溶性组分，其中所含的溶质分子具有大于5000道尔顿、或大于10000道尔顿、或大于30000道尔顿或大于100000道尔顿的分子量。在另一些实施方式中，细胞提取物可以包括可溶性组分，其中所含的溶质分子具有10000至100000道尔顿、或30000至100000道尔顿、或10000至30000道尔顿的分子量。
[0044]在一些实施发生中，癌细胞来自肿瘤。在一些方面，癌选自肝癌。在其他方面，癌是黑素瘤、神经胶质瘤、肾上腺、膀胱、骨、骨髓、脑、脊柱、胸、颈部、胆囊、神经节、胃肠道、胃、结肠、*脏、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰、甲状旁腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、子宫或乳腺的癌。
[0045]在多种实施方式中，本发明涉及与肿瘤细胞发育阶段相匹配阶段(即相同阶段)的细胞及其提取物的制备。具体地，分离不同发育阶段的胚胎细胞，细胞提取液或细胞培养液包括可溶的和不可溶的组分或其任何部分或组合。
[0046]本发明的药物具有多种应用，包括但不限于，抑制癌细胞生长或增殖、促进受损细胞或组织的修复和再生、促进组织再生、用于组织培养系统以培养细胞，例如干细胞、促进组织修复。
[0047]下面结合具体实施例1来描述本发明，应该指出的是，这些实施例1仅用于说明本发明不应理解为对本发明的限制。
[0048]实施例1
[0049]9-lld鸡胚肝提取物可显著抑制IfepG2的增殖
[0050]在无菌条件下，取不同发育阶段的鸡胚，分为对照组、3-5d、6-8d、9-lld、12-14d组，加入两倍体积的培养基，对胚胎进行匀浆处理，离心后，取上清液，过0.22 μ m滤膜，加入到HepG2肿瘤细胞培养基中(30%终浓度)，作用不同时间后进行照相观察和指标检测。
[0051]结果表明，9-11 d组H印G2细胞的增殖和癌症标记物AFP显著抑制，有统计意义(p〈0.01)，并伴有明显的形态变化。IfepG2细胞的变化在3-5d组不明显，而6-8d组表现为增殖。数据分析采用两样本均数比较t检验。(参见图1、图2、图3、图7)
[0052]实施例2
[0053]13.5-14.5d鼠胚肝共培养可显著抑制IfepG2的增殖
[0054]在无菌条件下，取不同发育阶段的小鼠胚肝，分为对照组、12.5(1、13.5(1、14.5(1、15.5d组。原代培养的鼠胚肝细胞鉴定后，与肝癌H印G2细胞共培养。！fepG2细胞(105)生长在6孔板底，胚肝细胞(107)共培养于Transwell小室内。共培养不同时间后，进行照相观察和指标检测。
[0055]结果表明，13.5-14.5d组大多数HepG2细胞变圆、皱缩和漂起，而只有小部分贴壁细胞。13.5-14.5d组!fepG2的增殖率和癌症标记物AFP显著抑制，有统计意义(p〈0.01或p〈0.05)。12.5d组和15.5d组HepG2细胞的变化不明显。数据分析采用两样本均数比较t检验。(参见图4、图5、图6、图7)
[0056]实施例3
[0057]胚肝细胞或其提取液促进HepG2的成熟
[0058]鸡胚液的实验处理同实施例1，而小鼠胚肝细胞的实验处理同实施例2。48h后，Real time PCR检测肝癌增殖标志基因Myc、肝细胞分化标志基因HNF-4 α的基因表达。
[0059]结果表明，9-1 Id鸡胚液组和13.5-14.5d鼠胚肝细胞共培养组，Myc基因表达显著抑制，而HNF-4a基因表达显著增高，有统计意义(?〈0.01或？〈0.05)。数据分析采用两样本均数比较t检验。(参见图8和图9)
[0060]实施例4
[0061]13.5d鼠胚肝细胞培养基消除荷瘤裸鼠的HepG2肿瘤
[0062]小鼠胚肝细胞的实验处理同实施例2。胚肝细胞培养48h后，收集培养基，过滤后，用于荷瘤部位皮下注射，每天一次。使用lX107HepG2CellS注射到裸鼠皮下，以制作荷瘤小鼠模型。实验分为对照组和治疗组，给药组荷瘤裸鼠持续给药lld，而瘤块的变化持续观察 15d0
[0063]结果表明，随着打药天数的增加，瘤块逐渐缩小，实验结束时，给药组瘤块完全消失。(参见图10和图11)
[0064]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【主权项】
1.与肿瘤细胞发育阶段相匹配的细胞及其提取物在制备抑制癌细胞生长或增殖的药物中的应用，其中所述与肿瘤细胞发育阶段相匹配的细胞包括从干细胞分化到成熟细胞或胚胎发育过程中经历的所有阶段的细胞。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提取物为细胞裂解物、分泌物以及细胞间质中的一种或者两种以上的混合物。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞及其提取物来自干细胞、自体、异源和/或动物的细胞或胚胎组织。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞及其提取物来自鼠胚和/或鸡胚组织。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中所述细胞及其提取物为可溶的组分、不可溶的组分或可溶的组分与不可溶组分的混合物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其中所述可溶的组分指这样的培养基:在其中细胞被培养并且分泌活性剂到其中，并且含有没有沉积的蛋白质和生物成分的培养基；和/或，其中所述不可溶的组分包括细胞分泌到胞外的基质蛋白和/或细胞分泌到胞外的生物组分。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，其中所述可溶的组分还包括核酸、蛋白因子、肽、脂类、小分子物质和各种糖基化修饰。8.根据权利要求1一 7任一项所述的应用，其特征在于，其中所述细胞及其提取物单独或联合应用。9.根据权利要求1一 7任一项所述的应用，其特征在于，其中所述肿瘤细胞包括所有被诊断为恶性肿瘤的细胞类型。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，其中所述癌细胞为黑素瘤、神经胶质瘤、肾上腺、膀胱、骨、骨髓、脑、脊柱、胸、颈部、胆囊、神经节、胃肠道、胃、结肠、心脏、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰、甲状旁腺、阴茎、前列腺、唾液腺、皮肤、脾、睾丸、胸腺、子宫或乳腺的癌细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种与肿瘤细胞发育阶段相匹配的细胞及其提取物的新用途，即在制备抑制癌细胞生长或增殖的药物中的应用，其中所述与肿瘤细胞发育阶段相匹配的细胞及其提取物，包括从干细胞分化到成熟细胞或胚胎发育过程中经历的所有阶段的细胞，而提取物包括细胞裂解物、分泌物和细胞间质等。其作用机理为通过与肿瘤细胞发育阶段相匹配的细胞及其提取物，诱导肿瘤细胞分化成熟，从而抑制癌细胞生长或增殖，达到治愈肿瘤的目的。利用含有与肿瘤细胞发育阶段匹配的细胞和/或其提取物的药物，诱导肿瘤细胞分化成熟，抑制其无限生长，最终实现肿瘤的治愈。
【IPC分类】A61P35/00, A61K35/545, A61K35/57
【公开号】CN104887710
【申请号】CN201510332443
【发明人】齐锦生
【申请人】齐锦生
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月16日