马红球菌致病基因VapA重组蛋白的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及马红球菌致病基因VapA蛋白的应用。
【背景技术】
[0002] 马红球菌属于红球菌属，是一种人畜共患的条件性致病菌。该病原菌普遍存在于 自然环境土壤中，调查表明，50~95%的农场土壤中存在该菌。马红球菌可感染人，导致呼 吸道感染症状。该病也是幼龄马驹最常见的疾病之一，发病率可达80%。染病马驹一般呈慢 性或亚急性支气管肺炎症状，有时伴发盲结肠和肠系膜淋巴结溃疡。
[0003] -直以来关于马红球菌的致病机制并不清楚，直至最近研宄发现，导致该细菌毒 性的关键是其是否含有一个致病性相关质粒。该质粒含有85~90kb的遗传编码DNA，可编 码多个高免疫原性的毒性脂蛋白。其中，毒性相关蛋白A(VapA)为其主要表达蛋白。大量 研宄表明，马红球菌的毒性与VapA密切相关。目前，虽有部分重组VapA蛋白表达的报道， 但其表达的蛋白多以包涵体的形式存在，较难应用于实际的医疗诊断和治疗产品的开发和 应用。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，提供马红球菌致病基因 VapA蛋白的应用。
[0005] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗由马红球菌引起的疾病的制剂中的应 用，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1 所示。
[0006] 申请人通过研宄发现，MBP-VapA蛋白更接近马红球菌致病基因VapA的性质，因此 MBP-VapA蛋白在中和抗马红球菌抗体时具有很高的活性。
[0007] 因此，本发明还提供了马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备检测由马红球 菌引起的疾病的制剂中的应用，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的 MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0008] -种制备治疗马红球菌病的免疫血清的方法，包括以下步骤： 51. MBP-VapA重组蛋白的制备：扩增VapA基因，并克隆到PMAL-C5X载体上，构建表达 载体PMAL-VapA，将PMAL-VapA转化至原核表达菌，通过IPTG在20°C下诱导获得MBP-VapA 重组蛋白； 52. 将纯化后的MBP-VapA重组蛋白与免疫佐剂混合后免疫动物，获得免疫血清。
[0009] 本发明使用PMAL-C5X载体，它可以促进重组表达蛋白的可溶性表达，实验研宄表 明，包涵体形式表达重组蛋白影响其氨基酸折叠形成正常的蛋白质三级、四级拓扑结构的 形成，进而影响重组表达蛋白的抗原性和生物活性。本研宄首次采用PMAL-C5X为载体，对 马红球菌的致病基因VapA进行了重组，获得重组质粒一PMAL-VapA。
[0010] 另外，发明人通过实验发现，单单使用PMAL-C5X载体，对VapA蛋白的可溶性表 达虽然有促进作用，但作用并不明显，还必须要配合低温诱导的温度，才能够使VapA蛋白 大量可溶性表达，发明人研宄了多个诱导温度对VapA蛋白的表达影响，结果显示，只有在 20°C时才能够获得大量的可溶性的VapA蛋白，该VapA蛋白带有MBP标签。
[0011] 本发明通过上述方法获得了大量可溶性表达且活性好的VapA蛋白，该蛋白具有 良好的免疫原性。
[0012] 优选的，所述本发明所述免疫动物可以是兔子或小鼠，免疫血清可以是兔抗马血 清，也可以是鼠抗马血清。
[0013] 更优选地，本发明所述免疫动物为兔子，免疫血清是兔抗马血清。
[0014] 发明人将纯化后获得的MBP-VapA蛋白进行ELISA检测，结果表明纯化的MBP-VapA 可用于纪特异性抗体的检测。
[0015] 优选地，本发明所述原核表达菌在培养至0D_值为0.5~0.7后，加入IPTG进行 诱导；更优选地，原核表达菌在培养至〇D_值为0.6后加入IPTG进行诱导。
[0016] 优选的，本发明所述IPTG诱导的浓度为0. 3~0. 7mM，诱导时间为8~12h。
[0017] 更优选地，申请人发现所述原核表达菌在20°C培养下，IPTG诱导浓度为0. 7mM，且 诱导时间为8h时，VapA蛋白的表达量最高，且多为可溶性表达。
[0018] 具体地，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白通过以下方法获得： 51. 重组质粒PMAL-VapA的构建：设计SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所述引物扩增 VapA基因，将VapA基因与pZeroBack/blunt载体相连构建质粒pZeroBack-VapA;最后将 PMAL-c5x和测序正确的pZeroBack-VapA进行双酶切后构建表达载体PMAL-VapA; 52. 将PML-VapA转化入BL21菌中，测序鉴定为阳性之后，将菌液接种于培养基中， 培养至〇D_值为0. 5~0. 7,加入IPTG诱导后，离心重悬菌体，破碎菌体，收集上清，获得可 溶性VapA蛋白。
[0019] 优选地，S2中原核表达菌在培养至OD6cJ直为0. 6后加入IPTG进行诱导。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果如下： 本发明提供了马红球菌致病基因VapA重组蛋白在制备治疗由马红球菌引起的疾 病的制剂中的应用，其特征在于，所述马红球菌致病基因VapA重组蛋白为带MBP标签的 MBP-VapA，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该重组蛋白几乎全部以可溶表达的形式存 在。该重组蛋白具有良好的免疫原性，适于临床治疗用高免血清抗体和疫苗的制备、临床诊 断试剂的开发。
【附图说明】
[0021] 图1为VapA基因的PCR扩增图；其中，I:VapA;2 :ddH20对照；M:2000bp的DNA分 子量标准。
[0022] 图2为重组克隆质粒pZeroBack-VapA的酶切鉴定；其中，I:pZeroBack_VapA重组 质粒的及I和I双酶切产物；M:5000bp的DNA分子量标准。
[0023] 图3为重组表达质粒PMAL-VapA的测序鉴定结果；下划线部位分别为yVMI与 feo/PI的酶切位点序列。
[0024] 图4为不同诱导温度对蛋白表达量的影响；其中，M:蛋白分子量标准；I:IPTG诱 导前的蛋白表达；2-6:分别在10°〇、15°〇、20°〇、28°〇和37°〇温度下诱导的蛋白表达。
[0025] 图5为不同IPTG诱导时间对蛋白表达量的影响；其中，M:蛋白分子量标准；1-8分 别为IPTG诱导0、2、4、8、12、16、20和24小时的蛋白表达。
[0026] 图6为不同IPTG浓度对诱导蛋白表达量的影响；其中，M:蛋白分子量标准；1-7: IPTG浓度分别为：0、0? 1、0. 3、0. 5、0. 7、1. 0 和L4mM。
[0027] 图7为20°C下0. 7mMIPTG诱导8h后表达的蛋白；其中，M:蛋白分子量标准；1:诱 导前BL21细菌的蛋白表达；2 :诱导后BL21细菌的蛋白表达；3转化空表达载体PMAL-C5X 的BL21诱导前蛋白表达；4 :转化空表达载体PMAL-C5X的BL21诱导后蛋白表达；5 :转化空 表达质粒PML-VapA的L21诱导前蛋白表达；6 :转化表达质粒PML-VapA的BL21诱导后的 蛋白表达；7 :经亲和层析纯化后的VapA蛋白；8 :诱导表达VapA蛋白的BL21菌液超声破碎 上清(含可溶性表达蛋白）;9 :诱导表达VapA蛋白的BL21菌液超声破碎沉淀(含包涵体表达 蛋白）。
[0028] 图8为不同温度诱导表达的VapA蛋白的状态分析；M:蛋白分子量标准；I:IPTG诱 导前转化BL21 (含PML-VapA)的蛋白表达；2和3分别为：20°C诱导表达产物的超声破碎 上清(含可溶性表达蛋白）和沉淀(含包涵体表达蛋白）;4和5分别为：28°C诱导表达产物的 超声破碎上清和沉淀；6和7分别为：37°C诱导表达产物的超声破碎上清和沉淀。
[0029] 图9为纯化后VapA蛋白的Western-blot分析结果；其中，1:纯化的VapA蛋白； M:蛋白分子量标准。
[0030] 图10为MBP-VapA重组蛋白的Dot ELISA分析，其中，1至3孔为BSA，蛋白浓度分 别为：0? lmg/mL、0. 025mg/mL、0. 00625mg/mL ;4孔为PBS对照，5孔为马红球菌（ATCC33701) 裂解液阳性对照；6至8孔为VapA蛋白浓度分别为0. lmg/mL、0. 025mg/mL、0. 00625mg/mL。
[0031] 图11为抗原抗体稀释度图。
[0032] 图12为HRP酶标二抗稀释度优化结果图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本 发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单 修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术 人员所熟知的常规手段。
[0034] 实施例1原核表达重组质粒PMAL-VapA的构建与鉴定 1、马红球菌的复苏与培养：购买保藏于美国菌种保藏中心，保藏号为ATCC33701的马 红球菌，按照规定操作流程复苏马红球菌。
[0035] 2、引物设计：根据NCBI基因库中马红球菌致病基因VapA序列（JN990991. 1)以及