一种新型α-葡萄糖苷酶活性抑制剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型a-葡萄糖苷酶活性抑制剂，属于功能食品的功能因子和药 物领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种以血糖过高为主要特征的全球性内分泌系统疾病，其中，II型糖尿 病占到90%以上，降低血糖含量是预防和治疗糖尿病的重要途径。有研宄预测，全球糖尿 病患者将从2000年的1. 71亿增加到2030年的3. 66亿，发病率居高不下，而发展中国家糖 尿病人数可能会翻倍。国际糖尿病联合会报告指出，全球每年都有5百万人死于糖尿病，到 2014年底，用于糖尿病治疗费用已逾5. 66千亿，因此，预防和治疗糖尿病的工作刻不容缓。
[0003] a-葡萄糖苷酶抑制剂通过竞争性抑制或非竞争性抑制小肠刷状边缘a-葡萄糖 苷酶的活性，延迟多糖、双糖转化为可吸收的葡萄糖，减缓血糖的升高。常见的降糖药一一 阿卡波糖，米格列醇，伏格列波糖均为化学或半化学合成，虽然有一定的降血糖效果，但临 床应用中存在胃胀、腹泻、肝损害等副作用，因此我们需要从自然界中寻找天然副作用少的 葡萄糖苷酶抑制剂。多项研宄报道，茶叶提取物具有防癌抗肿瘤、预防心血管疾病、调节 血糖血脂、预防糖尿病等多种药理功能，但研宄多集中在茶多酚和蛋白质酪氨酸磷酸酶上。 茶色素是从茶叶中的茶多酚经氧化聚合而成的酚性色素，由茶黄素、茶红素和茶褐素组成。
[0004] 本发明证明茶色素能够抑制a-葡萄糖苷酶活性，有很好的预防血糖快速升高的 效果，如果能作为食品添加剂或控糖药物，将会在糖尿病的防治领域具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种新型a-葡萄糖苷酶活性抑制剂，所述抑制剂是红茶茶 色素。
[0006] 所述红茶茶色素包括茶黄素、茶红素和茶褐素。经测定，醇溶性茶黄素、茶红素和 茶褐素的IC5tl分别为3. 94yg/ml、3. 24yg/ml、75. 43yg/ml，水溶性茶黄素、茶红素和茶褐 素的IC5tl分别为8. 19yg/ml、4. 50yg/ml、6. 98yg/ml，无论醇溶性茶色素还是水溶性茶色 素，对a-葡萄糖苷酶的抑制效果远远优于阿卡波糖（IC5tl= 1.04mg/ml)。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述红茶茶色素是以江苏宜兴红茶为原料，通过有 机溶剂萃取的方式得到的天然产物，经体外实验证明对a-葡萄糖苷酶的活性有强烈抑 制，其来源于红茶，毒副作用少，对a-葡萄糖苷酶的抑制效果远远高于目前控制II型糖尿 病的一线药物拜糖平（阿卡波糖）。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，采取以下步骤获得所述红茶茶色素：
[0009] (1)将干燥的红茶茶叶与80%乙醇按1§:2〇-3〇1^的比例混合，浸泡2411，过滤，滤 液浓缩蒸发乙醇，得到醇提茶色素，醇溶性茶色素提取物用适量的水转溶；滤渣用60°C热 水浸提，重复2-3次，合并每次的浸提液，蒸发水分得到浓缩的水提茶色素；
[0010] (2)向上述醇提茶色素中加入等体积的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡碱，保 留水相；向上述水提茶色素中分别加入等体积的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡碱，保 留水相；两水相分别独立进行后续提取过程；
[0011] (3)向水相中加入等体积的乙酸乙醋，萃取3次并合并，得到乙酸乙酯相和水相；
[0012] (4)向第（3)步中的乙酸乙酯相加入等体积的2. 5%的似110)3溶液，以除去部分 茶红素，保留有机相，并用截留分子量为100-500Da的透析袋透析除盐，然后蒸发有机溶剂 得到茶黄素；
[0013] (5)向第（3)步中的水相加入等体积的正丁醇，萃取3次并合并，得到有机相和水 相，蒸发有机相中的正丁醇即得到茶红素；
[0014] (6)蒸发第（5)步水相中残留的正丁醇即得到茶褐素；
[0015] (7)将得到的茶黄素、茶红素和茶褐素样品真空冻干，分别得到干燥的醇溶性和水 溶性的茶黄素、茶红素和茶褐素。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述红茶茶叶是宜兴红茶。
[0017] 本发明提供的宜兴红茶中提取的茶黄素、茶红素和茶褐素三种茶色素能强烈抑制 a_葡萄糖苷酶活性，且这三种茶色素是从茶叶中提取的天然色素，安全无毒，具有常用的 降糖药物拜糖平所不具备的优势。通过抑制肠道中糖类的消化酶a-葡萄糖苷酶活性，红 茶色素将成为功能性食品添加剂或药剂，在预防和治疗糖尿病中发挥作用。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明一种实施方式中提取茶色素的工艺流程图
【具体实施方式】
[0019] 茶色素对a-葡萄糖苷酶活性的抑制作用的测定：
[0020] A.测定原理：以无色的对硝基苯酚-a-D-葡萄糖苷（pNPG)作为反应底物，a-葡 萄糖苷酶水解a-1，4-葡萄糖苷键会释放出对硝基苯酚（PNP)，对硝基苯酚（PNP)在碱性条 件下显黄色，通过在405nm下测定吸光度的变化间接测定酶活的抑制情况。测定体系如下： 在500yL磷酸盐缓冲液体系（pH6. 8)中，加入250yLa-葡萄糖苷酶抑制剂和事先溶于缓 冲液中500 1^2臟〇1/1的？咿6,37°〇下预热51^11，再加€[-葡萄糖苷酶250 1^，371：反应 30min，然后再加ImlNa2CO3终止反应，405nm下测吸光度。
[0021] a-葡萄糖苷酶活性抑制率计算公式：
[0022]
[0023] 为既加酶也加抑制剂时的吸光度；A^ee为加抑制剂不加酶时的吸光度； 为加酶不加抑制剂时的吸光度；A5iffiee为既不加酶也不加抑制剂时的吸光度（其它用缓 冲液补充至相应的体积）。
[0024] B.测定方法：各个物质对a-葡萄糖苷酶的抑制能力用半数抑制浓度（IC5tl)来 衡量，当抑制率为50%时，所对应的抑制剂的浓度即为IC5tl。将冻干后的醇溶性和水溶性 茶黄素、茶红素和茶褐素用蒸馏水配成25yg/ml、20yg/ml、10yg/ml、5yg/ml、2. 5yg/ ml、lyg/ml，阳性对照阿卡波糖用蒸馏水配成浓度为5mg/ml、2. 5mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、 0.lmg/ml的浓度梯度，按上述测定体系测定每个稀释浓度对a-葡萄糖苷酶的抑制能力， 并计算IC5(I。
[0025] 实施例1茶色素的提取
[0026]干燥的宜兴红茶茶叶：体积浓度为80%的乙醇=1:20-30(g:mL)，浸泡24h，过滤， 滤液浓缩蒸发乙醇后用水转溶，得到醇提茶色素；滤渣用60°C热水浸提2h，重复2-3次，合 并每次的浸提液，蒸发水分得到浓缩的水提茶色素。向醇提茶色素和水提茶色素中分别加 入等体积的氯仿，萃取3-5次，去除蛋白和咖啡碱，保留各自的水相，分别用于后续提取步 骤。
[0027] 向水相中加入等体积的乙酸乙酯，萃取3次并合并乙酸乙酯相，得到乙酸乙酯相 和水相。
[0028] 对上一步得到的乙酸乙酯相，向乙酸乙酯相加入等体积的2. 5%的似110)3溶液，保 留有机相，用截留分子量为100_500kDa的透析袋透析除盐，并蒸发有机溶剂得到茶黄素样 品。对上一步得到的水相，向水相中加入等体积的正丁醇，萃