白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组合物的医药用途和制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属医药技术领域，具体涉及一种白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物及其组 合物的制备方法以及它在治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【背景技术】
[0002] 白发为白发属亚兰科植物，又名连及草、甘根、白给、箬兰、朱 兰、紫兰、紫蕙、百笠。多年生草本球根植物(块根)，植株高18-60cm。叶4-6枚，狭长圆形 或披针形，长8-29厘米，宽1. 5-4厘米，先端渐尖，基部收狭成鞘并抱茎。花序具3-10朵 花，常不分枝或极罕分枝。白芨原产中国，广布于陕西南部、甘肃东南部、江苏、安徽、浙江、 江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川和贵州。日本以及缅甸北部也有分布。
[0003] 白芨味苦、甘、涩，性寒，归肺、肝、胃经。有收敛止血，消肿生肌之功效。用于咳血 吐血，外伤出血，疮疡肿毒，皮肤皲裂，肺结核咳血，溃疡病出血。现代药理学研宄表明，白芨 具有止血、保护胃黏膜、抗菌、抗真菌、抗癌及防癌等作用。在高通量筛选的过程中，本发明 意外地发现大叶白芨具有很好的抑制丁酰胆碱酯酶的活性，该活性提取物及其组合物有望 应用于治疗阿尔茨海默病（AD)等方面的医药用途。
【发明内容】
[0004] 本发明所解决的技术问题是提供白芨提取物。
[0005] 本发明还提供了以白芨提取物为主要活性成分的组合物。
[0006] 本发明同时提供了白芨提取物及其组合物的制备和应用。
[0007] 本发明是通过如下技术方案实现的： 维吾尔药白芨经超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，用石油 醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱(石油醚-丙酮，比例见表1)，各石油醚-丙酮比例混合溶剂洗 脱液，浓缩，干燥后，利用体外筛选体系测试其丁酰胆碱酯酶抑制活性，意外地发现先用石 油醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:10,体积比）洗脱，继用石油醚-丙酮混合溶剂(石 油醚：丙酮，100:100,体积比）洗脱得到的石油醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:100， 体积比）洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物。而其他比例的 洗脱部位，没有丁酰胆碱酯酶抑制活性的作用。以上条件最优为先用石油醚-丙酮混合溶 剂(石油醚-丙酮，100:10,体积比）洗脱25倍柱体积，继用石油醚-丙酮混合溶剂(石油 醚-丙酮，100:100,体积比)洗脱20倍柱体积，洗脱液即为本发明丁酰胆碱酯酶抑制活性的 提取物。丁酰胆碱酯酶抑制活性的提取物，可以通过以上方法得到富集，从而与其他杂质类 成分分离开。该白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其薄层色谱（TLC)分 析结果见图1，TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1)显色 方法：香草醛-硫酸显色。
[0008] 具体，发现过程如下： 1、白芨经甲醇超声提取物的制备 取维吾尔药白芨20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SNOl18样品0.2158g，留样0.4229g，上柱2. 0521g，拌样硅胶2.0g，空白硅胶10g，石 油醚-丙酮系统。
[0009] 2、石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱方法和结果 取维吾尔药白芨20g，经100mL甲醇超声提取15min，提取液浓缩后，得提取物SNOl18样品0.2158g，留样0.4229g，上柱2. 0521g，上硅胶柱色谱，拌样硅胶2.0g，空白 硅胶10g，玻璃柱内径2.0cm，石油醚-丙酮系统梯度洗脱(条件见表1)，柱体积250mL， 每个梯度洗脱200mL，得到各个浓度提取洗脱液的洗脱物，回收溶剂，即得石油醚：丙酮梯 度洗脱提取物，TLC分析结果见图2,图3,TLC分析条件：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙 酸乙酯：丙酮（6:1:1)，石油醚：乙酸乙酯：丙酮（3:1:1)显色方法：香草醛-硫酸显色。
[0010] 表 1
3、抑制丁酰胆碱酯酶活性筛选方法和结果 1) 实验条件 a、 材料：DMSO(二甲基亚砜）（科密欧公司）；KH2P04、K2HP04WH2CK广东汕头市西陇化 工厂）；BuChE酶（美国Sigma公司）；PNPG(美国Sigma公司） b、 实验仪器：多功能酶标仪Bio-RadModel680 型（Bio-RadLaboratoriesInc.) 2) 实验方法和过程 样品处理：将Img待测样品溶于20 二甲基亚砜（DMSO)作为母液，取I母液 加入249 蒸馏水配成200 .mr1的溶液。
[0011] 丁酰胆碱酯酶抑制活性测定方法： 在96孔板上测定样品的BuchE抑制活性。具体操作如下：在96孔板中依次加入25 PBS (100 mM，pH 8.0)，25 BuChE (彡 0.04 U/mL，pH 8.0 PBS 溶解稀释），25 样品溶液（200 ? ml/1)。加 25 BuSCH(l. 6 mM, pH 8. 0 PBS 溶解稀释）及 25 DTNB (4.0 mM，pH 8.0 PBS溶解稀释），37°C孵育60 min后，用酶标仪在412 nm下测 定其吸光度值。样品抑制百分率按以下公式计算： 酶活性抑制率％=[A空白_(A样品-A背景）]/ A空白X 100 式中Aee :不加样品反应后的吸收值； :加入样品反应后的吸收值； Awft :只加样品的吸收值。
[0012] 3)实验结果 表2
结果发现： 本发明最优方案为：维吾尔药白芨经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上 样后的硅胶柱，先用石油醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:10,体积比）洗脱，继用石油 醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:100,体积比）洗脱，用石油醚-丙酮混合溶剂(石油 醚：丙酮，100:100,体积比）洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即为该丁酰胆碱酯酶抑制 活性提取物。该丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物从未见文献报道，其TLC分析表征如图1。
[0013] 4、丁酰胆碱酯酶抑制活性有效提取物的提取方法研宄 1)提取溶剂的种类研宄 分别用甲醇、丙酮、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合溶剂、乙醇水混合溶剂等有机 溶剂提取，并测试提取物的丁酰胆碱酯酶抑制活性，实验结果如下： 表3
研宄结果表明：提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混 合溶剂、乙醇水混合溶剂。
[0014] 2)提取溶剂的用量研宄 分别用1、2、5、10、20、30、40、50倍(重量/体积比)有机溶剂提取，并测试提取物的丁酰 胆碱酯酶抑制活性，结果如下： 表4
活性提取物的提取所用有机溶剂用量为药材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0015] 3)干燥方法的研宄 分别用真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法等方法，对得到的抑 制丁酰胆碱酯酶活性提取物进行干燥，以含水量、TLC、活性测试为指标，发现真空干燥法、 冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干燥法适用于对丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物进行 干燥，其中，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0016] 表 5
优选地，白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物的制备方法为： 维吾尔药白芨经溶剂超声提取，提取液浓缩后，用硅胶柱分离，上样后的硅胶柱，先用 石油醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:10,体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，继用石 油醚-丙酮混合溶剂(石油醚-丙酮，100:100,体积比）洗脱，洗脱2-50倍柱体积，用石油 醚-丙酮混合溶剂(石油醚-丙酮，100:10,体积比)洗脱的洗脱液经回收有机溶剂，干燥，即 为该活性提取物。以上条件最优为先用石油醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:10,体积 比）洗脱20倍柱体积，继用石油醚-丙酮混合溶剂(石油醚：丙酮，100:50,体积比）洗脱15 倍柱体积。
[0017] 其中， 1)提取物提取用有机溶剂可以为甲醇、石油醚、水、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇水混合 溶剂、乙醇水混合溶剂，最优条件为甲醇和95%乙醇。活性提取物提取用有机溶剂用量为药 材重量的2-50倍(重量/体积比)。
[0018] 2)提取物干燥方法可以为真空干燥法、冷冻干燥法、鼓风干燥、离心干燥、旋蒸干 燥法等，最优为真空干燥法、冷冻干燥法。
[0019] 5、白芨抑制丁酰胆碱酯酶活性提取物(洗脱液为100 :100时干燥所得提取物）的 医药用途研宄 按优化的白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物制备方法制备的活性提取物，经测试，其 丁酰胆碱醋酶抑制活性为IC5(I=16. 3yg/mL。
[0020] 由于丁酰胆碱酯酶抑制剂具有治疗阿尔茨海默病等方面的医药用途。因此，我们 发现的白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提取物具有广泛的医药用途。
[0021] 6、白芨抑制丁酰胆碱酯酶活性提取物的组合物及其制备方法研宄 1)固体分散体 处方 白芨提取物 20 g Vc Ig 聚乙烯吡咯烷酮 79 g 固体分散100g制备方法： 称取白芨提取物和载体聚乙烯吡咯烷酮（PVP)按比例1:2、1:4、1:6的质量比分别放入 烧杯中，加入适量的无水乙醇和Vc，用磁力搅拌器搅拌至白芨提取物和载体完全溶解，充分 混合均匀后转入旋蒸仪中除去有机溶剂，干燥，粉碎过80目筛，即得白芨有效提取物PVP包 合物。
[0022] 2)环糊精包合物 处方： 白芨提取物 20 g Vc Ig 0 -环糊精 79 g 包合物100g制备方法： 将0 -环糊精与1-5倍水研匀，加白芨有效提取物(水难溶性的应先溶于少量有机溶剂 中）继续充分研磨至成糊状物，低温干燥即得环糊精包合物。
[0023] 3)分散片处方： 白芨提取物 1〇〇 十>烷基硫酸纳 1 Vc 1 预胶化淀粉 10 可溶性淀粉 100 交联聚维酮 10 微晶纤维素 9 微分硅胶 0. 3 滑石粉 1 100片 制备方法： 1. 白芨有效提取物分散体的制备，精密称取白芨提取物、Vc，加入处方量的十二烷基硫 酸钠，用适量的浓度为70%乙醇溶解并加入等比例的可溶性淀粉混合均匀后，在70°C的温 度下蒸干，粉碎，过100目筛； 2. 将第一步中的白芨有效提取物淀粉分散体与处方量的交联聚维酮，预胶化淀粉，用 适量的浓度为70%乙醇做湿润剂，边加入边搅拌，制成湿颗粒过14目筛，室温下放置15min 后，60°C烘箱烘干45min，16目筛整粒，加入处方量的滑石粉和微分硅胶，混合均匀后，压 片即得。
[0024] 7、白芨抑制丁酰胆碱酯酶活性提取物的检测方法研宄 我们发现，可以用薄层色谱的方法，很好地检测和标示白芨丁酰胆碱酯酶抑制活性提 取物的特征。见图1 具体条件为：GF254硅胶板，展开系统：石油醚：乙酸乙酯：丙酮