通过棕榈酰化修饰酪氨酸酶调节黑色素生成的制作方法
【专利说明】通过棕榈酰化修饰酪氨酸酶调节黑色素生成
[0001]相关申请的交叉引用
本申请要求2012年12月20日提交的美国临时申请号61/740，048的优先权。
[0002]发明背景。
发明领域
[0003]本发明涉及黑色素合成的调节。更具体地，本发明涉及改变酪氨酸酶的活性的组合物和方法。
[0004]现有技术的描述
人皮肤和毛发的色素沉着是世界上人们的关注问题。在一些情况下，期望具有总体较亮的肤色。最通常地，人们希望具有均匀的肤色，无论底层颜色。所有人都希望延缓灰发的出现，这是衰老的迹象。
[0005]皮肤和毛发的色素沉着由被称为黑色素细胞的专门细胞控制。黑色素细胞在其内含有被称为黑色素体的细胞器，其制造各种形式的黑色素(包括黑色真黑色素和红色褐黑色素)，然后黑色素细胞将其分布在皮肤或毛发内。黑色素的生物合成中最重要的酶是酪氨酸酶，并且其抑制已经是被设计为使肤色光亮的大多数商业产品的焦点。
[0006]酪氨酸酶是一种金属蛋白，其在核糖体合成，通过高尔基体转运至前黑色素体，然后载入其中。当前黑色素体成熟时，铜分子也作为酪氨酸酶的辅助因子载入其中，并且pH增加以达到所述酶的最佳值。成熟黑色素体然后开始合成黑色素。
[0007]酪氨酸酶的转运没有得到充分理解。近来，蛋白的棕榈酰化已经作为哺乳动物蛋白的亚细胞定位的机制受到关注(综述于T.1wanaga, R.Tsutsumi, J.Noritake,Y.Fukata, M.Fukata “Dynamic protein palmitoylat1n in cellular signaling,Progress in Lipid Research 48:117-127，2009; C.Salaunj J.Greaves, L.Chamberlain uThe intracellular dynamic of protein palmitoylat1n，， J.CellB1l.191:1229-1238， 2010; C.Aicart-Ramosj R.Valero, 1.Rodrigues-CrespouProtein palmitoylat1n and subcellular trafficking，， B1ch.B1phys.Acta1808:2981-2994.2011)。在任何这些综述中都没有公开酪氨酸酶作为棕榈酰化的目标。
[0008]发明概述
根据本发明的一个方面，提供了用于增加需要此类增加的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法，其包括用DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21或22的一种或多种抑制剂处理皮肤或毛发。
[0009]根据本发明的第二个方面，提供了用于通过用PPT型酶的一种或多种抑制剂处理皮肤或毛发而减少需要此类减少的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法。
[0010]根据本发明的第三个方面，提供了用于通过用至少一种棕榈酰化肽处理皮肤或毛发而减少需要此类减少的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法。
[0011]根据本发明的第四个方面，提供了用于增加哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素增加有效量的DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21或22的一种或多种抑制剂。
[0012]根据本发明的第五个方面，提供了用于减少哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素减少有效量的PPT型酶的一种或多种抑制剂。
[0013]根据本发明的第六个方面，提供了用于减少哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素减少有效量的至少一种棕榈酰化肽。
[0014]本发明的其它方面和目的将从随后说明书和权利要求变得更加显而易见。
[0015]附图简述
图1是蛋白棕榈酰化的循环的示意图。
[0016]图2A和2B描绘棕榈酰化抑制剂(2-BP)对酪氨酸酶的棕榈酰化的影响。
[0017]图3A和3B代表2-BP对NHEM和重构的人皮肤模型中的黑色素合成的影响。
[0018]图4A和4B说明2-BP对酪氨酸酶的mRNA表达和糖基化的影响。
[0019]图5A和5B代表2-BP对酪氨酸酶的降解的影响。
[0020]图6描绘2-BP对酪氨酸酶的泛素化的影响。
[0021 ] 图7代表2-BP对酪氨酸酶棕榈酰化的影响。
[0022]图8是蛋白的DHHC (棕榈酰化)家族的图示。
[0023]图9代表筛选酪氨酸特异性DHHC的结果。
[0024]图1OA和1B说明DHHC 2、3、7和15沉默对MNT-1细胞中的酪氨酸酶棕榈酰化的影响。
[0025]图1lA和IlB代表NHEM中的DHHC 2、3、7和15_myc的细胞内定位的分析。
[0026]图12A和12B说明人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点。
[0027]图13A和13B说明人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点。
[0028]图14A-14D描绘PP_2和KA对NHEM中的黑色素合成的影响。
[0029]图15代表PP-2和KA对人酪氨酸酶(D0PA氧化)体外活性的影响。
[0030]图16描绘PP-2对NHEM中的酪氨酸酶蛋白的影响。
[0031]本发明优选实施方案的详述
蛋白棕榈酰化或S-酰化是影响许多蛋白的定位和活性的可逆的翻译后脂质修饰。如图1中示意表示，棕榈酰化是通过棕榈酰基酰基转移酶(PAT)完成的将棕榈酸基团结合至蛋白的半胱氨酸残基的酶促过程。PATS共享DHHC结构域(天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸特征基序)，并且在哺乳动物细胞中存在23或24个单独的含DHHC蛋白，每个都具有其自身的底物特异性。对于含DHHC蛋白的目标的共有序列是未知的，除了其含有半胱氨酸。几十种蛋白被棕榈酰化，并且名单尚不完整。含DHHC蛋白主要定位于高尔基体膜中，在那里它们通过其合成后不久的棕榈酰化引起目标蛋白的重定位。
[0032]棕榈酰化是通过普遍定位于胞质溶胶的酰基蛋白硫酯酶(APT)和棕榈酰基蛋白硫酯酶(PPT)酶促可逆的。哺乳动物细胞中似乎存在几种APT，但只存在两种PPT。棕榈酰化蛋白被转运远离高尔基体，并且结合至核内体、溶酶体或质膜。作为重定位的后果，它们可被降解(例如，在溶酶体中)，或者它们可以变为PPT的底物，改变它们的定位和/或返回至高尔基体用于重新棕榈酰化。以这种方式，DHHC PAT和APT/PPT的相对活性决定蛋白的定位，无论是否更集中于高尔基体附近或分散至核内体或质膜。该系统是动态的，其中蛋白恒定地来回穿梭且被降解。
[0033]Dawson等人描述了棕榈酰基:蛋白硫醋酶(PPTl)的抑制剂(Dawson, G.，Schroeder, C.，Dawson, P.Palmitoyl: protein th1esterase (PPTl) inhibitorscan act as pharmacological chaperones in infantile Batten Disease.B1ch.B1phvs.Res.Comm.395:66-69，2010.)。N 端添加亲脂性荧光团 NBD 的抑制剂 CS38(NBD- β AGDap (Pal) VKIKK)是比 Dapl (Ac⑶ap (Pal) VKIKK)好 3 倍的抑制剂。CS38 是具有2 μΜ的IC5tl的最有效的肽抑制剂。真正巯基的NBD形式(CS8:GGC(Pal) VKIKK)具有与CS38相当的抑制活性。经设计以促进细胞摄取的具有TAT样聚精氨酸(R7)尾区的其它肽(AcO)ap (Palm) GGR7)也是强烈的 PPTl 抑制剂(例如 AcOTap (Pal) GG) R) 7)。VKIKK 的任何截短消除抑制活性。APT的抑制在阻断黑色素生成中的效力要低得多。
[0034]关于棕榈酰化在黑色素生成中的作用几乎一无所知。在影响黑色素生成的基因的基因组范围筛选中，基因ZDHHC9被鉴定为其中通过siRNA的抑制减少黑色素生成的基因(A.Ganesan, H.Ho, B.Bodemann, S.Petersen, J.Aruri, S.Koshy, Z.Richardson,L.Le, T.Krasieva, M.Roth, P.Farmer, M.White αGenome-wide siRNA funct1nalgenomics of pigmentat1n identifies novel genes and pathways that impactmelanogenesis in human cells”.PLOS Genetics 4(12):el000298, do1:10.1371/journal, pgen.1000298, 2008)。针对该 PAT 的 siRNA 抑制 MITF (microthalmia 相关转录因子)RNA和酪氨酸酶蛋白积累。酪氨酸酶蛋白的siRNA抑制由与巴弗洛霉素的孵育所抑制，这升高了溶酶体的PH且抑制蛋白降解。他们表明，他们的筛选方法鉴定了影响黑色素体蛋白货物的黑色素体转运/分选的新型基因。然而，他们暗示棕榈酰化的抑制应减少黑色素生成。事实上，如本发明中未覆盖，棕榈酰化的总体抑制增加了黑色素生成，并且PATDHHC9不是酪氨酸酶的特异性修饰剂。
[0035]Wu等人研宄了黑色素调节素(melanoregulin)的棕榈酰化，所述黑色素调节素是以其棕榈酰化形式防止黑色素从黑色素细胞转移至角质形成细胞的蛋白(X.Wu, J.Martina, J.Hammer “MelanoreguIin is stably targeted to the melanosome membraneby palmitoylat1n” B1ch.B1phys.Res.Comm.426:209-214.)。棕榈酰化将黑色素调节素蛋白定位至黑色素体，从而抑制从黑色素细胞转移黑色素。据观察，黑色素调节素的棕榈酰化的抑制降低了其在溶酶体的积累，并且通过推断，降低了其在黑色素体中的积累。Wu等人没有呈现关于黑色素生成或酪氨酸酶的任何证据。
[0036]本发明在于本发明人的以下令人惊讶的发现:酪氨酸酶的棕榈酰化/去棕榈酰化在黑色素生成中发挥作用。更具体地，本发明人已发现，PAT(棕榈酰基-酰基转移酶或DHHC)在黑色素细胞中对酪氨酸酶的棕榈酰化导致酪氨酸酶被转运远离黑色素体，导致皮肤和毛发中黑色素的出现的降低。本发明人推断，酪氨酸酶远离黑色素体的改变定位导致其降解。此外，酪氨酸酶的棕榈酰化的抑制，即PAT的抑制，据推测导致酪氨酸酶在黑色素体中的保留，和皮肤和毛发中黑色素的出现的增加。抑制PAT的化合物包括2-溴棕榈酸盐(2-BP)。如下面实施例中显示，本发明人已经确定，负责酪氨酸酶棕榈酰化的PAT是DHHC2、3、7和15，而DHHC 6、11、17、21和22显示微弱亲和力，且DHHC 9似乎不会棕榈酰化酪氨酸酶。进一步确定，酪氨酸酶在半胱氨酸500上棕榈酰化，因为将该氨基酸突变为丙氨酸阻断了所述酶的棕榈酰化。
[0037]本发明人已经进一步发现，如下面实施例中显示，抑制负责酪氨酸酶的去棕榈酰化的PPT (棕榈酰基-蛋白硫酯酶)，导致酪氨酸酶的降解增加和皮肤和毛发中黑色素的出现的降低。棕榈酰化肽；即，含有棕榈酰化氨基酸的肽，抑制PPT。可用于本发明目的的示例性肽包括棕榈酰化肽-1或PPl (甘油聚甲基丙烯酸酯(和)PEG-8(和)棕榈酰基寡肽，其含有100 ppm的棕榈酰化六肽棕榈酰基-val-gly-val-ala-pro-glu)(可作为B1peptideEL购自Sederma)，和棕榈酰化肽_2或PP2 (水(和)丁二醇(和)葡聚糖(和)棕榈酰基三肽_8，其含有500 ppm的由精氨酸、组氨酸和苯丙氨酸组成的棕榈酰化三肽)(可作为Neutrazen 购自 Lucas Meyer Cosmetics)。
[0038]DHHC, PPT和/或APT的抑制剂