的标准Ig Y1载体（Science 301 (5638):1374-1377)以编码后面有6x-His 标签的IgGlC11I域生成的6xHis-IgCy 1表达载体中。将编码PGT121eM(S32Y、K53D、S54R、 N58T、H97R、T1001Y)和 10-1074GM(Y32S、D53K、R54S、T58N、R97H、Y1001T)突变体抗体的 IgH DNA片段以合成小基因（IDT)获得，并亚克隆入Ig Y1表达载体中。
[0135] 下文列出10-1074eM的重链序列，其中突变是加下划线的。10-1074 eM的轻链序列 与10-1074的轻链序列相同。
[0136] QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVS ⑶ SMNNSYWTWIRQSPGKGLEWIGYISKSESAPNPSLNSRVVI SRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCATARHGQRIYGVVSFGEFFTYYSMDVWGKGTTVTVSS
[0137] 通过使用聚乙烯亚胺（PEI)沉淀法（PLoS One 6(9) :e24078)将IgH和IgL表达 质粒瞬时转染入指数生长的HEK 293T细胞（ATCC，CRL-11268)中来生成抗体和Fab片段。 使用蛋白G Sepharose珠 （GE Healthcare)依照制造商的用法说明亲和纯化IgG抗体。使 用HisPur?钴树脂（Cobalt Resin) (Thermo scientific)亲和纯化Fab片段，如下文描述 的。
[0138] HIV-IEnv 蛋白
[0139] 使用QuikChange定点诱变试剂盒（Stratagene)依照制造商的用法说明将丙氨酸 突变在位置 301 至 303 (Asn-Asn-Thr)、324 至 325 (Gly-Asp)、和 332 (Asn) (HXBc2 氨基酸编 号方式）处引入 pYU_2 gpl20 载体（J. Sodroski, Harvard Medical School 的赠品）中。使 用相同的规程通过在位于Asr^eZgpl2ci和Asn406 ^5l2tl之间的每个PNGS处将单丙氨酸突变引 入pYU-2 gpl20N332A载体来生成"双重聚糖"突变体。通过DNA测序确认定点突变。
[0140] 使用编码 YU-2 gpl40 (Journal of virology 74(12) :5716-5725)、YU-2gpl20、 HXB2c gpl20core (Nature 393 (6686) : 648-659) , HXB2c 2CCcore (PLoS Pathog 5(5):e100 0445)蛋白、和YU-2 gpl20突变体蛋白的表达载体来转染HEK 293T细胞。为 了生成仅高甘露糖YU-2 gpl20蛋白（gpl20kif)，在转染时添加25μΜ几夫碱（Enzo Life Sciences)。将培养物上清液收获，并使用基于离心的过滤装置（Vivacell 100, Sartorius Stedim Biotech Gmbh)浓缩，该装置容许样品对IOmM咪挫、50mM磷酸钠、300mM氯化钠 （pH 7. 4)的缓冲液更换。通过使用HisPur?钴树脂（Thermo scientific)依照制造商的用法 说明进行亲和层析纯化蛋白质。
[0141] 对于脱糖基化反应，将PBS中的50yg HEK 293T细胞生成的YU-2 gpl20用 在其不含变性剂的相应反应缓冲液中的200U PNG酶F (New England Biolabs)或 10, OOOU Endo Hf (New England Biolabs)于 37°C消化过夜。在施用离心滤器Amicon? Ultra, Millipore)对PBS进行缓冲液更换后，通过使用4-12% NuPAGE凝胶（Invitrogen) 的SDS-PAGE，接着通过银染色（Pierce银染色试剂盒，Thermo Scientific)检查经糖苷酶 处理的 gpl20s(200ng)。
[0142] ELISA
[0143] 用PBS中的IOOng/孔纯化的gpl20包被高结合96孔ELISA板（Costar)过夜。在 清洗后，将板用2% BSA、1 yM EDTA、0. 05% Tween-PBS(封闭缓冲液）封闭2小时，然后与 26. 7nM浓度的IgG (或对于使用YU-2 gp 120双重聚糖突变体的ELISA为427. 2nM)和PBS 中的7个连续1:4稀释物一起温育2小时。在清洗后，通过与缀合有HRP的山羊抗人IgG 抗体（Jackson ImmunoReseach)(在封闭缓冲液中为0. 8 μ g/ml) -起温育1小鼠，并通过 添加 HRP生色底物（ABTS溶液，Invitrogen)显现板（PLoS One 6(9): e24078)。使用先前 描述的肽-ELISA法测试抗体对选择的gpl20V3重叠肽的结合。
[0144] 对于竞争ELISA，经gpl20包被的板用封闭缓冲液封闭2小时，然后与PBS中抗体 竞争物的1:2连续稀释溶液（5. 2至667nM的IgG浓度范围）中的生物素化的抗体（对于 PGT121 浓度为 26. 6nM，对于 10-1074 为 0. 21nM，对于 10-996 为 0. 43nM 以及对于 10-1369 为I. 67nM) -起温育2小时。使用缀合有HRP的链霉亲合素 （Jackson ImmunoReseach)(以 封闭缓冲液中的〇.8μg/ml)显现板，如上文描述的。至少一式两份实施所有实验。
[0145] 聚糖微阵列分析
[0146] 通过在两个水平上（2和5fmol/点）一式两份将与脂质连接的聚糖探针（拟糖 脂（neoglycolipid))机器打印到硝酸纤维素包被的玻璃载玻片上（Methods Mol Biol 808:117-136)来产生微阵列。用含有15种源自高甘露糖和复合型的N-聚糖的拟糖脂的 微阵列实施结合测定法。图7A中显示了探针的序列。简言之，以50μg/ml测试抗体，并且 用生物素化的抗人IgG(Vector)，接着用经AlexaFluor 647标记的链霉亲合素 （Molecular Probes)检测结合。
[0147] 表面等离振子共振
[0148] 使用 Biacore TlOO (Biacore, Inc)实施实验（Nature 467(7315) :591-595)。简 言之，将YU-2 gpl40和gpl20蛋白在CM5芯片（Biacore，Inc.)上以300RU的偶联密度用 伯胺偶联。分别以1 μ M和10 μ M，以35 μ Ι/min的流速以3分钟结合和5分钟解离相在流 动池上注射抗gpl20IgG和种系前体（GL)。通过以50 μ Ι/min的流速30秒注射IOmM甘氨 酸-HCl pH 2. 5再生传感器表面。在不进行体积反射指数（bulk reflective index, RI) 校正的情况中使用1:1结合模型（Biacore TlOO评估软件）在扣除背景后自动力学分析计 算解离（Ms，）、结合（ka(M^)和结合常数（K d(M)或Ka (if1)。使用1:1结合模型计算的 二价IgG的结合常数在教科书中称为"表观"亲和力以强调K d值包括潜在的亲合力效应。
[0149] 中和测定法
[0150] 使用TZM. bl细胞中基于萤光素酶的测定法评估病毒中和（J Virol79 (16) : 10108-10125)。测试的 HIV-I 假病毒主要含有 tier-2 和 tier-3 病毒 (Journal of virology 84(3) :1439-1452)(表4和 5)。在用 25μ M 几夫喊（Enzo Life Sciences)处理的野生型细胞中（图8C)或在HEK 293S GnTI-A细胞（图8D)中生成仅高 甘露糖的假病毒。使用非线性回归分析来计算观察到半最大抑制的浓度（IC5tl值）。还使 用主要HIV-I变体（η = 95)感染用先前表征的基于PBMC的测定法评估中和活性，所述主 要HIV-I变体从具有1985和1989年之间（"历史血清转化者"，η = 14)或2003和2006 年之间（"当代血清转化者"，η = 21) (Journal of virology 85(14) :7236-7245 ;Nat Med 16(9) :995-997)的已知血清转化数据的进化枝B感染供体分离。使用GraphPad Prism软件 (v5. Ob)以最佳拟合曲线下的面积计算每种抗体的中和活性，所述最佳拟合曲线拟合相对 于范围为0. 001至50 μ g/ml的IC5tl值标准化的病毒比例。通过相对于最高值（用10-1074 获得）标准化所有AUC值得到曲线下的相对面积（RAUC)值。
[0151] 统计学分析
[0152] 用GraphPad Prism软件（v5. Ob)实施统计学分析。使用Spearman相关检验分析 针对gpl20和gpl40的抗体在针对选择的一组9种病毒株的TZM-bl测定法中的中和效力 对表观结合亲和力。使用Mann Whitney检验来比较：（i)属于PGT121或10-1074组的抗体 对gpl20/gpl40的亲和力，和（ii)针对从历史和当代血清转化者分离的病毒的中和活性。
[0153] 晶化和结构确定
[0154] 表达有6x-His标签的PGT121、10-1074和10-996GL Fab以进行晶化。通过序贯 的 Ni2+-NTA 亲和力（Qiagen)和 Superdex200 10/300 (GE Healthcare)大小排阻层析从经 瞬时转染的HEK 293-6E细胞的上清液纯化Fab。对于无配体PGT121 Fab的晶体，通过蛋白 A亲和层析（Pierce)从经瞬时转染的HEK 293-6E细胞的上清液分离PGT121 IgG，并且通 过木瓜蛋白酶切割IgG以及使用Superdex200 10/300(GE Healthcare)大小排阻层析的进 一步纯化获得Fab片段。
[0155] 将纯化的Fab浓缩至PBS缓冲液中的8-20mg/mL ( "无配体" PGT121，8mg/mL ; 10-1074和GL，20mg/mL)。从蛋白质样品（终浓度：15mg/mL)制备"有配体"PGT121 Fab晶 体，所述蛋白质样品与3倍摩尔过量的NA2聚糖混合，并且于20°C温育2小时。使用1:1蛋 白质与储器比率在400nL液滴中使用Mosquito?晶化自动仪器（TTP labs)于20°C筛选 晶化条件。在24%PEG 4,000,0·lMTris-HClpH8·5，10mMCuCl2中获得"无配体'^PGT121 Fab 的晶体（PSpjya = 56. 8，b = 74. 7, c = 114.9 A )，并且"有配体''PGT121 Fab 的晶 体（P212121;a = 67·8，b = 67·8，c=94·丨A)在17%PEG 10,000,0·lMBis-TrispH5·5， 0· IM CH3-COOHNh4中生长。在 25% PEG 3, 350,0· IM Bis-Tris pH 5· 5,0· 2M NaCl 中获得 10-1074Fab 的晶体（P21;a = 61. 4, b = 40. 3, c = 84.5 Α; β = 95. 39° )，并且 GL Fab 的 晶体（P21;a = 54. 9，b = 344. 7, c = 55.2 A; β = 91. 95。）在 20% PEG 3, 350,0· 24Μ 丙 二酸钠 pH 7.0, IOmM MnCl2中生长。通过在含有20%甘油（"无配体"和"有配体" PGT121 Fab)或20%乙二醇（10-1074Fab和GL Fab)的母液中浸透冷冻保护晶体，随后在液氮中快 速冷冻。
[0156] 在6M像素检测仪（Dectris)上在斯坦福同步福射光源（Stanford Synchrotron Radiation Lightsource，SSRL)以光束线 12-2(波长=1.029 A)收集衍射数据。使 用XDS将数据索引化（index)，合并并换算（scale)。使用从"无配体" PGT121 Fab晶体 获得的数据，我们使用Phenix在省略CDRH3和CDRL3环中的残基后使用两种搜索模型 PGT128Fab (PDB代码3PV3)的Ch - Q域和2F5 (PDB代码3IDJ)的V H - \域来寻找每个不 对称单位的一个Fab的分子替换办法（对于重链和轻链分别为链H和L)。随后，我们使用 "无配体" PGT121结构作为搜索模型来寻找"有配体" PGT121 Fab (每个不对称单位的一个 Fab)、10-1074Fab (每个不对称单位的一个Fab)和GL (每个不对称单位的四个Fab)的分子 替换办法。
[0157] 使用Phenix并且使用Coot将模型手动拟合到电子密度图中来实施迭代细化（包 括GL的非结晶学对称限制）。将原子模型细化至3.0 A分辨率（对于PGT121 Fab) 〇^作= 21.6%;%离=26.4%)，1.9人分辨率（对于1〇-1〇74卩&13)〇?工作=18.7% ;%离=22.3%)， 2.4 A.分辨率（对于4个GL Fab分子）（R工作=19. 4% ;R游离=23. 7% )，和'2.4 A.分辨率 (对于"有配体'TGTm Fab(R工作=2〇. 1%;R游离=Μ. 9% )。PGTm Fab的原子模型在拉 马钱德兰（Ramachandran)图的有利（favored)、容许（allowed)和不许（disallowed)区中 分别含有 95. 2%、4· 9%和 0· 0%残基（10-1074Fab :98· 8%，0· 9%，0· 2%;GL Fab :96· 0%， 3. 8%，0· 23% 有配体"PGT121 Fab :96· 7%，3· 1%，0· 2% )。使用 PyMOL 进行分子显现， 并且产生Fab结构的图。使用1.4 A:探针用Areaimol (CCP4Suite)实施掩埋表面积计算。
[0158] 使用PyMOL中的Super脚本比对Fab结构。使用PDBeFold实施成对C α比对。
[0159] 实施例2 :PGT121克隆型的优势和多样性
[0160] 使用YU-2 gp 140三聚物作为"诱饵"从进化枝A感染非洲裔供体分离gp 140特异性 IgG记忆B细胞。鉴定出与23种独特的克隆家族对应的87种匹配的免疫球蛋白重（IgH)和 轻（IgL)链基因。IgH抗gpl40全集以占所有扩充B细胞克隆的约28%的1个克隆家族占 优势。此B细胞家族对应于与PGT121-123 (Nature 477(7365):466-470)相同的克隆，并且 含有38个成员，其中29个在核苷酸水平上是独特的变体（表3)。基于其IgH核苷酸序列， PGT121家族分成两组：含有PGT121-123和9种紧密相关变体的PGT121样组，和含有20个 成员的第二组10-1074样。虽然我们的传统引物（J Immunol Methods 329(1-2):112-124; Science 301 (5638):1374-1377)由于编码框架区1的区域中的核苷酸缺失而没有扩增出 由PGT121B细胞克隆表达的IgL基因，使用设计为扩增重度体细胞突变基因的新IgA特 异性引物获得38种IgA基因中的24种（表3)。与IgH基因中的高水平超突变（平均为 18. 2%的V λ基因）一致，扩增的IgA基因是高度突变的（平均为18. 2%的V λ基因）， 并且携带框架区I(FWRl)中的核苷酸缺失（12至21个核苷酸）和框架区3(FWR3)中的9 核苷酸插入（图3B和表3)。
[0161] 图 3(a)和 3(b)中显示了 3 种 PGT 抗体（PGT-121，-122,和-123)，7 种 PGT121 和 10-1074 克隆变体（10-259,10-303,10-410,10-847,10-996,10-1074,10-1121，10-1130， 10-1146,10-1341，10-1369,和10-1074GM)，可能地种系（GL)，和共有序列的序列比对。下 文表1中列出了 IMGT和KABT系统两者下相应重链可变区、轻链可变区、重链⑶R、和轻链 CDR的序列。下文表2中列出了 KABT系统下序列的分配的序列标识号：
[0162]
[0167] 11种新的独特变体是表达的（表3)，并且通过ELISA和表面等离振子共振（SPR) 证明对YU-2 gpl20和gpl40的结合。除非另有记录，在哺乳动物细胞中表达用于这些和其 它实验的gpl20和gpl40蛋白，所述哺乳动物细胞能将复合型或高甘露糖N-聚糖附着到 PNGS。与gpl20的反应性水平在属于PGT121和10-1074组的抗体间有所不同，后者展现出 更高的表观亲和力（图3A)，这主要是由于10-1074相关抗体自gpl20/gpl40解离更慢（图 4B) 〇
[0168] 实施例 3 :PGT121 和 10-1074 表位
[0169] V3环茎附近的Asn332gpl2(l报告为对于PGT121的结合和病毒中和是至关重要的 (Nature 477(7365) :466-470)，如此我们检查V3在PGT121样和10-1074样抗体的抗原 识别中的作用。使用缺乏V1-V3环（gpl20 ttt' )或保留V3的一部分（2CC-核心）的HXB2 gpl20 "核心"蛋白，并且使用在V3茎中携带双重丙氨酸取代的YU-2 gpl20突变体蛋白质 (gpl20GD324_5AA)实施ELISA。测试的抗体显示在与完整YU-2 gpl20相比时降低的针对缺乏 V3环的变体和8ρ120-324-5ΑΑ的反应性，其中10-1074组抗体的结合是最受影响的（图5A和 B)。这些结果提示了这两个抗体组的识别牵涉V3环附近的蛋白质决定簇。抗体无一结合 跨越V3的重叠肽，这提示了靶定表位是不连续的和/或需要通过分离的肽没有实现的特定 构象（图5C)。
[0170] Asn332gpl2tl (以早期编号方式为 Asn337gpi2c1 (J Proteome Res7 ⑷：166〇-1674)) 是定义为序列Asn-X-Ser/Thr的潜在N-糖基化位点（PNGS)的N端残基。为了测定 △811332^^和/或其N-连接的聚糖是否是新的PGT121-和10-1074-组抗体的gpl20反应 性需要的，我们通过ELISA测试其对YU-2gpl20 N332%^结合。N332A取代降低PGT121和所有 新抗体变体的结合，而其针对缺乏邻近糖基化位点的突变体g P120(gpl20?T3°HAAA突变体） 的反应性是未变的。为了测定在AsnSSZ gpl2ciPNGS外的PNGS是否影响新抗体的识别，我们构 建一系列的11种双重聚糖突变体，其中YU-2 gpl20中的N332A突变是与位于Asn262gpl2Q 和AsMOegpl2tl之间的PNGS突变组合的。所有PGT121样和10-1074样抗体以与对gpl20 N332A 的亲和力相当的亲和力结合到每种双重聚糖突变体。
[0171] 为了比较PGT121-和10-1074-样抗体的总体聚糖识别，我们检查其对用PNG酶F 处理的YU-2 gpl20的结合，所述PNG酶F切割复合型和高甘露糖N-聚糖两者。由于gpl20 不能被完全酶促脱糖基化（除非它被变性），PNG酶F处理导致天然折叠的gpl20的部分脱 糖基化（图6)。不过，两组抗体的反应性的差异在于PNG酶F对gpl20的部分脱糖基化降 低所有PGT121样抗体但是无一 10-1074样抗体的结合反应性（图6C)。用经Endo H (其切 割高的甘露糖，而非复合型N-聚糖）处理的YU-2 gpl20进行的类似实验影响10-1074样 抗体超过PGT121样抗体的结合（图6D)。
[0172] N-聚糖微阵列揭示了 7种测试的PGT121样抗体中的6种显示对以半乳糖或 α 2-6-连接的唾液酸为末端的复合型单或双触角N-聚糖的可检测结合，但是对高甘露糖 型聚糖的结合检测不到，这确证并扩充没有PGT121-123对高甘露糖N-聚糖的结合和Man 4 和Man9枝状体（dendron)不竞争gpl20结合的先前报告（图7)。比较而言，10-1074样抗 体对无蛋白质聚糖没有可检测的结合（图7)。虽然PGT121样抗体结合无蛋白质复合型而 非高甘露糖N-聚糖，但是PGT121样抗体仍然结合用几夫碱（gpl20 kif)( -种甘露糖苷酶抑 制剂，其导致高甘露糖聚糖专门附着至PNGS)处理的细胞中生成的YU-2 gpl20(图8B)。大 多数PGT121样抗体展现出小的，但可再现的结合gpl20kif的降低。相反，10-1074样抗体仍 然完全结合gp 120kif (图8B)。这些结果与如下的假设一致：高甘露糖及复合型N-聚糖可以 参与PGT121样抗体的表位。
[0173] 通过竞争ELISA用每组的两种代表性成员（对于PGT121样组为PGT121和 10-1369 ;对于10-1074样组为10-1074和10-996)实施表位定位实验。所有4种抗体显 示交叉竞争，但是PGT121抑制10-996和10-1074对gpl20的结合比10-996和10-1074 抑制PGT121对gpl20的结合更适度。为了进一步定位祀定表位，我们使用抗gpl20抗 体，其识别V3环的冠（图5)，CD4bs，共受体结合位点（CD4诱导的；CD4i)，一群高甘露 糖 N-聚糖（2G12) (Journal of virology76 (14) :7293-7305 ;Proc Natl Acad Sci USA 102 (38) : 13372-13377))，或 V3 环和位置 301 和 332 处的 N-连接的聚糖（PGT128)。抗 V3 冠抗体抑制PGT121和10-1369的结合，但是不干扰10-996和10-1074的结合。PGT128和 (在更小的程度上）2G12,而非CD4bs和CD4i抗体降低所有4种抗体对gpl20的结合。
[0174] 总之，这些数据提示了 PGT121克隆成员识别牵涉V3环和Asn332gpl2(l相关聚糖附 近的蛋白质决定簇的位点。然而，克隆分成两个家族，即PGT121样和10-1074样组，其差异 在于它们对gpl20的亲和力及聚糖在表位形成中的作用。
[0175] 实施例4 :广泛且有力的HIV中和
[0176] 为了评估新PGT121变体的中和活性，我们使用10种病毒株（包括R1166. cl，其缺 乏gpl20位置332处的PNGS)来测量其抑制TZM-bl细胞的HIV感染的能力。所有PGT121 变体（包括10-1074样抗体）中和9种假病毒，并且无一中和Rl 166. cl对照（图IA和表 4)。中和活性与对HIV刺突的亲和力相关联，其中10-1074组比PGT121组显示略大的效 力（图IB和图4C)。PGT121/10-1074抗体克隆型的一种代表性种系型式（GL)不能结合 gpl20/gpl40或中和该组中的任何病毒，这暗示体细胞突变是结合和中和需要的。将GL轻 链与突变10-1074-或10-996-组重链配对不能挽救结合或中和，这提示了这两条突变链促 成抗体互补位的正确装配。
[0177] 实施接着的测定法以比较PGT121和两种10-1074样抗体（10-996和10-1074)针 对扩充的一组119种难以中和的假病毒（分类为tier-2和tier-3)的中和活性（表4和 5)。10-996和10-1074显示与PGT121相似的中和效力和宽度（图1C，图9,和表5和6)。如 预期的，大多数携带gpl20位置332和/或334 (跨越Asn332 - X - Ser334/Thr334 PNGS)处 的氨基酸变化的病毒对中和有抗性（83. 8%对PGT121有抗性，100%对10-1074和10-996 有抗性）。此PNGS处的突变占大多数对中和有抗性的病毒（对于10-996为68. 5%，对于 10-1074 为 72. 5%及对于 PGT121 为 60. 8% )(表 7)。对 PGT121 和 10-1074 的 IgG 和 Fab 形式观察到相当的中和活性，这提示了二价性对于其活性不是至关重要的（图1D)。
[0178] 为了评估HIV包膜上的复合型N-聚糖在PGT121和10-1074中和中的潜在作用， 我们以两种不同方式生成仅高甘露糖病毒体：通过在用几夫碱处理的细胞中装配假病毒 (这生成Man9GlcNAc2N-连接的聚糖），或者通过在HEK293S GnTI 细胞中装配（这生成 Man5GlcNAc2N-连接的聚糖）。我们发现了 PGT121中和3种经几夫碱衍生的PGT121敏感性 /10-1074抗性株中的2种，这与其在野生型细胞中生成的对应物等同（图8C)。GnTryIH 胞中生成的两种PGT121敏感性/10-1074敏感性病毒株与其在野生型细胞中生成的对应物 同等地对PGT121和10-1074敏感。与复合型N-聚糖部分保护⑶4结合位点免于抗体结合 的先前报告一致，GnTI 细胞中生成的病毒对⑶4结合位点抗体（NIH45-46 G54lP 3BNC60) 更敏感（图8D)。
[0179] 实施例5 :新型传播的HIV-I
[0180