一种柳生金针菇多糖蛋白复合物及其制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物开发领域，具体涉及一种柳生金针菇发酵液提取物及制备方 法和用途。
【背景技术】
[0002] 食药用菌是一类十分重要的天然生物资源，已成为当今新药发掘和功能食品开发 的重要研宄对象。研宄表明，食药用菌中含有多糖、蛋白、黄酮等多种活性物质，具有提高机 体免疫力、抗肿瘤、抗氧化等多种药理学作用。目前已有香菇多糖、灵芝多糖、猪苓多糖等通 过卫生部门批准，成为临床上抗肿瘤的免疫治疗药物。尽管已有大量食药用菌多糖被开发 和利用，但由于我国菌物资源丰富，野生食用菌超过2000多种，驯化栽培的食用菌种类超 过100种，商品化种类约为60个，因此，仍有大量食药用菌的食药用价值有待开发利用。柳 生金针葫（Flammulina rossica)隶属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、金钱菌属，是一种食用菌。 目前，国内外市场尚无柳生金针菇蛋白多糖相关产品，同时文献中也无任何关于柳生金针 菇多糖的提取及生物活性相关报道。因此本发明从柳生金针菇中获得免疫活性多糖的方法 及应用为柳生金针菇的深度发掘及多糖类免疫促进剂药物和功能食品的开发提供重要研 宄基础，具有重大的经济效益和社会效益。
【发明内容】
[0003] 本发明提供一种柳生金针菇多糖蛋白复合物及其制备方法及应用。
[0004] 本发明采取的技术方案是：包括下列步骤：
[0005] (一）发酵：将柳生金针菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度22-26?， 转速120-16017/1^11，培养5-6(1后，以10-20%接种量接入发酵培养基，发酵条件为 ：温度 22-26°C，转速 120-160r/min，培养 5-6d 后，4000r/min-6000r/min 离心收集上清液，获得粗 多糖蛋白复合物发酵液；
[0006] (二）提取：将步骤（一）所香粗多糖蛋白复合物发酵液经旋转蒸发浓缩至 原体积的1/10-1/8,加入3-5倍体积无水乙醇4°C沉淀12~16h，离心10-20min，转速 3000-5000r/min，收集沉淀，45-50°C干燥，即得。
[0007] 所述的种子培养基组成为：马铃薯200-300g ;葡萄糖15-20g，KH2PO4L 5-2. 0g， MgSO4 · 7H20,0· 75_lg，VB1，1-1. 5mg，水，1000mL。
[0008] 所述发酵培养基组成为：葡萄糖100_200g;玉米粉200-400g;酵母浸粉60g; KH2P04,1. 5-2. Og ;MgS04 · 7H20, 7. 5-10g ;VB1，10-15mg ;水，1000 mL0
[0009] 所述的柳生金针菇多糖蛋白复合物，通过苯酚-硫酸法测定其中多糖含量为 38% -46%，通过考马斯亮蓝法测定蛋白含量为12% -15%。
[0010] 所述柳生金针菇多糖蛋白复合物在制备具有免疫调节活性的药物中的应用。
[0011] 所述柳生金针菇多糖蛋白复合物在制备提高正常小鼠血清中的细胞因子INF-γ、 TNF-α和CRP的表达和脾淋巴细胞亚⑶47⑶8+的比值的药物中的应用。
[0012] 所述柳生金针菇多糖蛋白复合物在制备提高免疫抑制小鼠抗体生成细胞数量和 血清中血溶素含量，以及S180瘤小鼠的胸腺指数抑制其肿瘤生长的药物中的应用。
[0013] 本发明的积极效果在于：填补了市场上对柳生金针菇资源开发和利用的空白。同 时，对于深度开发多糖类免疫促进剂药物和具有免疫调节作用的保健食品开发提供了重要 的基础，具有重要的经济价值和市场价值。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1
[0015] ( -）发酵：将柳生金针菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度26°C， 转速12〇171^11，培养5(1后，以1()%接种量接入发酵培养基，发酵条件为 ：温度26°0，转速 120r/min，培养5d后，4000r/min离心收集上清液获得粗多糖蛋白复合物发酵液；所述柳 生金针菇多糖发酵种子培养基组成为：马铃薯200g ;葡萄糖15g ;KH2P041. 5g ;MgS04 · 7H20， 0. 75g ;VB1，Img ;水，1000 mL ;发酵培养基组成为：葡萄糖，100g ;玉米粉200g ;酵母浸粉， 60g ;KH2P04,1. 5g ;MgS04 · 7H20, 7. 5g ;VB1，IOmg ;水，1000 mL ；
[0016] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体1/10,加入3倍体积 无水乙醇4°C沉淀12h，3000r/min，离心10min，收集沉淀，45°C干燥获得免疫活性多糖蛋白 复合物。
[0017] 实施例2
[0018] ( -）发酵：将柳生金针菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度24°C，转 速14〇1'/1^11，培养5.5(1后，以15%接种量接入发酵培养基，发酵条件为 ：温度24°0，转速 140r/min，培养5d后，4000r/min离心收集上清液获得粗多糖蛋白复合物发酵液；所述柳生 金针菇多糖发酵种子培养基组成为：马铃薯250g ;葡萄糖17. 5g ;KH2P041. 75g ;MgS04 ·7Η20， 0. 88g ;VB1，I. 25mg ;水，1000 mL ;发酵培养基组成为：葡萄糖，150g ;玉米粉300g ;酵母浸粉， 60g ;KH2P04,1. 75g ;MgS04 · 7H20,8. 8g ;VB1，12. 5mg ;水，1 OOOmT,；
[0019] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体1/9,加入4倍体积 无水乙醇4°C沉淀14h，4000r/min，离心15min，收集沉淀，47. 5°C干燥获得免疫活性多糖蛋 白复合物。
[0020] 实施例3
[0021] (一）发酵：将柳生金针菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度22°C， 转速16〇171^11，培养6(1后，以2()%接种量接入发酵培养基，发酵条件为 ：温度22°0，转速 160r/min，培养6d后，6000r/min离心收集上清液获得粗多糖蛋白复合物发酵液；所述柳 生金针菇多糖发酵种子培养基组成为：马铃薯300g ;葡萄糖20g ;KH2P042. Og ;MgS04 · 7H20， Ig ;VB1，I. 5mg ;水，1000 mL ;发酵培养基组成为：葡萄糖，200g ;玉米粉400g ;酵母浸粉，60g ; KH2PO4, 2. Og ;MgS04 · 7H20, IOg ;VB1，15mg ;水，10OOmT,；
[0022] (二）提取：将粗多糖蛋白复合物发酵液旋转蒸发浓缩至原体1/8,加入5倍体积 无水乙醇4°C沉淀16h，5000r/min，离心20min，收集沉淀，50°C干燥获得免疫活性多糖蛋白 复合物。
[0023] 对上述实施例通过苯酚-硫酸法测定其中多糖含量为38% -46%，通过考马斯亮 蓝法测定蛋白含量为12% -15%。
[0024] 下边通过药效学试验来进一步说明本发明的效果。
[0025] 试验例1
[0026] 昆明雄鼠50只，随机分为5组，分为阳性对照组黄芪多糖、柳生金针菇多糖蛋白 复合物（简称本发明）高剂量组（500mg/kg)、中剂量组（250mg/kg)、低剂量组（125mg/kg) 和空白对照组生理盐水。灌胃给药，每天一次，连续30天。实验前12h断粮不断水，实验的 第30天进行眼球取血，取得血清，依照Elisa说明书方法进行TNF- a，INF- γ，CRP的含量 测定。实验结果见表1。
[0027] 表1柳生金针菇胞免疫活性多糖蛋白复合物对正常小鼠 TNF- a，INF- γ，CRP的 影响
[0029] 注：与空白对照组相比**Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05
[0030] 由表1结果可以看出，柳生金针菇多糖蛋白复合物可以极显著提高正常小鼠血清 中的TNF-α含量，同时可以显著提高正常小鼠血清中的INF-γ，CRP的含量。
[0031] 试验例2
[0032] 昆明雄鼠50只，随机分为5组，分为阳性对照组黄芪多糖、柳生金针菇多糖蛋白 复合物高剂量组（500mg/kg)、中剂量组（250mg/kg)、低剂量组（125mg/kg)和空白对照组生 理盐水。灌胃给药，每天一次，连续30天。实验前12h断粮不断水，第30天处死小鼠，取其 脾脏放置在300目筛网中，加入ImL培养液轻轻研磨，收集细胞，3000r离心5min，加入红细 胞裂解液使其裂解，离心后细胞沉淀呈现乳白色，用PBS洗两遍后，调整细胞个数到I X IO6 个/lOOyL，分别加入IOuL CD4-PE及CD8-APC，4°C避光染色lh，PBS洗两遍后使其重悬，流 式细胞仪检测。实验结果见表2.
[0033] 表2柳生金针菇多糖蛋白复合物对正常小鼠淋巴细胞亚群的影响
[0034]
[0035] 注：与空白对照组相比呷〈0. 01，*P〈0. 05
[0036] 由表2结果看以看出，柳生金针菇多糖蛋白复合物可以通过提高CD4+含量同时降 低CD8+含量来提高CD4 +/CD8+的比值，从而对正常小鼠起到提高免疫力作用。
[0037] 试验例3
[0038] 定量溶血分光光度测定法（QHS)测定抗体生成细胞。昆明雄鼠48只，随机分为6 组，即为正常对照组、模型对照组、柳生金针菇多糖蛋白复合物低剂量组（125mg/kg