一种由羧甲基壳聚糖介导的含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于氧化石墨烯复合材料的领域，特别涉及一种由羧甲基壳聚糖介导的含 透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的制备方法。
【背景技术】
[0002] 石墨烯自2004年被发现以来，因其优异的电学、光学、热学和机械性能而被认为 在复合材料、传感器、能源等领域具有重要的应用前景，成为近年来纳米领域研宄的热点。 而生物医学领域的研宄起步较晚，但是发展迅速。该领域应用较多的是由石墨粉经化学氧 化、超声分散而制得的氧化石墨烯。氧化石墨烯具有较大的比表面积，适合用作药物载体， 提高载药率。更重要的是，其表面含有大量的含氧活性官能团，如羟基、羧基、羰基、环氧基 等亲水性基团，因而具有良好的水溶液稳定性和生物相容性。然而它在生理盐水中由于电 荷屏蔽效应的存在易团聚，使其在生物医学领域的潜在应用价值的发挥受到阻碍。这一弊 端可以通过表面修饰的方法来加以改善，而其表面大量的官能团为此提供了可能性。经官 能化修饰的氧化石墨烯材料最终有望用作于可控释放的药物载体，在生物医药和诊断等领 域有着很好的应用前景。
[0003] 羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl chitosan，CMC)是一种水溶性壳聚糖衍生物，是 近年来出现的一种化工合成物，具有许多极具应用价值的特性，如抗菌抗感染性，保鲜作 用，降脂和防治动脉硬化等药理作用，因此在医药、化工、环保、保健品方面都有重要的意 义，也是近年来研宄得较多的壳聚糖衍生物之一。与壳聚糖相比，因为它既含有弱碱阳离 子（-NH 3+)基团，又含有弱酸阴离子（-CO(T)基团，是一种两亲性聚电解质，因此它具有更 好的生物相容性和生物可降解性，更适于应用于生物医学领域。另外，它具有柔性的分子骨 架，其上的羧基和未被取代的氨基可以作为氧化石墨烯和生物活性分子间友好的连接臂， 用于介导石墨烯的功能化修饰。
[0004] 透明质酸是一种独特酸性粘多糖，又名玻脲酸，以其独特的分子结构和理化性质 在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节血管壁的通透性等。它是肌肤水嫩 的重要基础物质，本身也是人体的一种成分，具有特殊的保水作用，份量更高达其本身重量 的100倍，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质，被称为理想的天然保湿因子。它还具 有较高临床价值的生化药物，广泛应用于各类眼科手术，如晶体植入、角膜移植和抗青光眼 手术等。另外还可用于治疗关节炎和加速伤口愈合。经透明质酸修饰后的氧化石墨烯具有 良好的生物相容性，有利于材料的生物应用，所得功能化纳米材料可以用作药物传输载体。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种由羧甲基壳聚糖介导的含透明质酸修饰 的氧化石墨烯复合材料的制备方法，该方法操作简单，反应条件温和。该方法制备得到的氧 化石墨烯复合材料可装载药物，用于药物的控制释放。
[0006] 本发明的一种由羧甲基壳聚糖介导的含透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料的 制备方法，包括：
[0007] (1)将氧化石墨烯GO分散在蒸馏水中，超声，在搅拌的条件下加入1- (3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC · HCl和N-羟基琥珀酰亚胺NHS，活化3h ;其中，GO氧 化石墨烯与EDC · HCl和NHS的质量比为1:0. 5:0. 25~1:1:0. 5 ;
[0008] (2)活化结束后加入羧甲基壳聚糖CMC水溶液，搅拌24h，透析，冷冻干燥，得到 GO-CMC ;其中，氧化石墨烯与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1~1:2 ;
[0009] (3)将透明质酸HA溶解在蒸馏水中，加入EDC · HCl和NHS活化3h ;其中，透明质 酸与活化剂EDC · HCl和NHS的摩尔比为1:1:0. 8 ;
[0010] (4)将步骤⑵中得到的GO-CMC溶于蒸馏水中，逐滴加入到步骤（3)中活化 的透明质酸中，搅拌反应24h，透析，冷冻干燥，得到含透明质酸的氧化石墨烯复合材料 GO-CMC-HA ;其中，GO-CMC与HA的质量比为1:5~1:10。
[0011] 所述步骤⑴中活化时间为3h。
[0012] 所述步骤⑵中搅拌的时间为24h。
[0013] 所述步骤⑶中活化的时间为3h。
[0014] 所述步骤（4)中的搅拌时间为24h。
[0015] 所述步骤⑵和步骤⑷中的透析为采用透析袋，先在pH为7-8的缓冲液中透析， 然后在蒸馏水中透析。
[0016] 所述的制备方法是在常温常压下进行。
[0017] 对由羧甲基壳聚糖介导的含透明质酸的氧化石墨烯复合材料的制备，我们做了一 些测试：（I)SEM测试结果
[0018] SEM测试结果表明：氧化石墨烯烃过透明质酸修饰过后依然保持其片层结构，即 修饰仅发生在表面，并不改变石墨烯本身的结构。参见附图1。
[0019] (2) NMR测试结果
[0020] NMR测试结果表明：以氧化石墨稀为模板，CMC及HA分子成功地接合在氧化石墨稀 的表面。参见附图2。
[0021] (3) TGA测试结果
[0022] TGA测试结果表明：按照尾端分析法，选取900°C为计算温度，修饰在氧化石墨烯 表面的CMC约为12. 5%，HA约为5. 6%。参见附图3。
[0023] (4) Zeta电位测试结果
[0024] Zeta电位测试结果表明：氧化石墨烯烃HA修饰后，呈电负性且电位升高，说明生 物相容性提高，且体系分散性较好。参见表1。
[0025] 有益效果
[0026] (1)本发明采用化学键合的方法，合成含有透明质酸修饰的氧化石墨烯复合材料， 制备方法简单，实验条件温和；
[0027] (2)本发明制备得到氧化石墨烯复合材料克服了氧化石墨烯在生理盐水中由于电 荷屏蔽效应而存在易团聚的缺陷；羧甲基壳聚糖作为介导，通过透明质酸的修饰，改善材料 的生物相容性，具应用其做后续相关实验分析的潜力；
[0028] (3)本发明制备得到的氧化石墨烯复合材料具备用作药物载体及控释体系的潜 力，有望提尚载药率，实现控制释放。
【附图说明】
[0029] 图1为实施例1中得到的GO-CMC-HA的SEM图；
[0030] 图 2 为实施例 2 中 G〇-CMC、G〇-CMC-HA 及 CMC、HA 的1H-NMR 图谱；其中，（a)为 CMC 的1H-NMR 图谱，（b)为 HA 的1H-NMR 图谱，（c)为 GO-CMC 的1H-NMR 图谱，（d)为 GO-CMC-HA 的1H-NMR图谱；
[0031] 图 3 为实施例 3 中的 GO、GO-CMC、GO-CMC-HA 的 TGA 图谱。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0033] 实施例1
[0034] (1)将20. 7mg GO加入8mL蒸馏水中，超声分散至均勾。然后在磁力搅拌条件下加 入15·6mgEDC·HCl和7·8mgNHS，进行搅拌活化反应3h。另将28·8mgCMC配制成5mg/ mL水溶液，在磁力搅拌条件下，逐滴加入上述已活化GO分散液中，在室温状态下搅拌反应 24h。最后将反应液转移至透析袋（MW= 100, 000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物 除去，先用PBS缓冲液透析3次，每次2L，再用超纯水透析6次。最后对样品进行冷冻干燥 处理后获得G0-CMC，密封保存于4°C冰箱待用。
[0035] (2)将 99. 3mg HA (MW = 6, 800)溶于 IOmL 蒸馏水中，加入 2. 8mg EDC .HCl 和 I. 4mg NHS，进行搅拌活化3h，另将21. 4mg GO-CMC配制成5mg/mL水溶液，在磁力搅拌条件下，逐 滴加入活化后的HA水溶液中，室温条件下搅拌反应24h。最后将反应液转移至透析袋（MW =8, 000-14, 000)中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析3次， 每次2L，再用超纯水透析6次。最后对样品进行冷冻干燥处理后获得G0-CMC-HA，密封保存 于4°C冰箱。
[0036] (3)