针对活化蛋白c的人源化单克隆抗体及其用图
【专利说明】针对活化蛋白C的人源化单克隆抗体及其用途
[0001] 序列表 根据37 C.F.R. 1.821 (C)，序列表随同作为ASCII标准文本文件提交，所述ASCII标 准文本文件命名为"BAYRP0002USP1_ST25"，于2013年11月25日创建并且具有~25千字 节的大小。前述文件的内容由此整体引入作为参考。
[0002] 优先权声明 本申请要求于2012年11月29日提交的美国临时申请系列号61/731，368的优先权利 益，所述美国临时申请的完整内容由此引入作为参考。
[0003] 背景 1.刖目 血液凝固是由多种血液成分或因子的复杂相互作用组成的过程，其最终导致纤维蛋白 凝块。一般地，参与凝血"级联"的血液组分是酶原（proenzymes or zymogens)--无酶 活性的蛋白质，其通过活化剂的作用转换成活性形式。血液凝固的调节在很大程度上由活 化蛋白C (aPC)实现的促凝血因子Va和VIIIa的蛋白水解失活酶促完成（Esmon，1989)。
[0004] 蛋白C是aPC的前体，所述aPC是有力的天然抗凝剂。蛋白C通过与血栓调节蛋 白（TM)复合的凝血酶活化。活化通过内皮细胞蛋白C受体（EPCR)得到增强。TM和EPCR 可以由于炎性介质例如肿瘤坏死因子而下调，由Esmon (1999)综述。TM和EPCR也已发现 在一些形式的败血症休克特别是脑膜炎球菌血症中降低。因为EPCR和TM在内皮上表达， 所以不可能在不去除血管的情况下直接确定它们的功能的好坏。
[0005] aPC通过蛋白水解切割和下调促凝血因子来充当抗凝剂。aPC还发挥作为抗凋亡 剂、抗炎症分子和细胞保护剂的重要功能。可以通过去除aPC来治疗出血病症或外伤患者， 在所述出血病症中稳态通过关键因子丧失(例如在血友病中因子VIII的不存在)而失调，在 所述外伤患者中创伤过程导致暂时性止血丧失。但是，除去除抗凝血活性之外，此类治疗还 可导致去除aPC的有益功能的不希望的有害后果。因此，希望具有选择性靶向aPC的抗凝 血活性而使该分子的其他功能完整保留的治疗剂。
[0006] 概述 因此，提供了包含下述的抗体：（a)包含由SEQ ID NO: 1、2和3表示的重链⑶R的重 链；和（b)包含由SEQ ID NO: 4、5和6表示的轻链⑶R的轻链。抗体可以是人源化抗体， 并且可以具有下述序列组成： 表1 -抗体序列
[0007] 重链构架区可以由SEQ ID NO: 7、8、9和10表示，或者具有5个或更少的保守氨 基酸置换，和/或轻链构架区可以由SEQ ID NO: 11、12、13和14表示，或者具有5个或更 少的保守氨基酸置换。例如，SEQ ID NO: 8的残基14可以由Ala置换，和/或SEQ ID NO: 9的残基11、13和31可以分别由丝氨酸、缬氨酸和异亮氨酸置换；和/或重链可以包含SEQ ID NO: 16-24。另外例如，SEQ ID NO: 11的残基4可以由亮氨酸置换，和/或SEQ ID NO: 13的残基12可以由精氨酸置换；和/或轻链包含SEQ ID NO: 26-30。抗体可以是单链抗 体或抗体片段，例如Fab'、Fab、F (ab'）2、单结构域抗体、Fv或scFv。还提供的是包含在药 学可接受的载体中分散的前述实施方案中任一个的药物组合物。
[0008] 公开内容还提供了包含编码抗体的核酸的表达构建体、细胞或细胞系，所述抗体 包含（a)包含由SEQ ID NO: 1、2和3表示的重链⑶R的重链；和（b)包含由SEQ ID NO: 4、5和6表示的轻链⑶R的轻链。抗体可以是人源化抗体。重链构架区可以由SEQ ID NO: 7、8、9和10表示，或者具有5个或更少的保守氨基酸置换，和/或轻链构架区可以由SEQ ID NO: 11、12、13和14表示，或者具有5个或更少的保守氨基酸置换。例如，SEQ ID NO: 8的 残基14可以由Ala置换，和/或SEQ ID NO: 9的残基11、13和31可以分别由丝氨酸、缬 氨酸和异亮氨酸置换；和/或重链可以包含SEQ ID NO: 16-24。另外例如，SEQ ID NO: 11 的残基4可以由亮氨酸置换，和/或SEQ ID NO: 13的残基12可以由精氨酸置换；和/或 轻链包含SEQ ID NO: 26-30。抗体可以是单链抗体或抗体片段，例如Fab'、Fab、F (ab'）2、 单结构域抗体、Fv或scFv。
[0009] 还提供的是抑制对象中的活化蛋白C抗凝活性的方法，其包括施用有效量的根据 上文描述的抗体。
[0010] 还提供的是抑制对象中的活化蛋白C酰胺分解活性的方法，其包括施用有效量的 根据上文描述的抗体。
[0011] 还提供的是治疗需要血液凝固的对象的方法，其包括施用有效量的根据上文描述 的抗体。
[0012] 还提供的是治疗患有败血病的对象的方法，其包括施用有效量的根据上文描述的 抗体。该方法可以进一步包括活化蛋白C的施用。
[0013] 还提供的是治疗患有血友病的对象的方法，其包括施用有效量的根据上文描述的 抗体。
[0014] 还提供的是调节对象中的止血的方法，其包括施用有效量的根据上文描述的抗 体。对象可以是外伤患者。
[0015] 还提供的是调节对象中的血栓形成的方法，其包括施用有效量的根据上文描述的 抗体。
[0016] 另外一个实施方案包括包含根据上文描述的抗体的试剂盒。抗体可以例如用下述 进行标记：荧光团、放射性标记、化学发光标记、染料、量子点、珠或生色团。试剂盒可以进一 步包含缓冲剂或稀释剂，和/或所述抗体的使用说明书。抗体可以以水性悬浮液存在，或是 冻干的。
[0017] 考虑本说明书中讨论的任何实施方案均可对于任何化合物、方法或组合物实现， 并且反之亦然。
[0018] 由于下述详述，其他目的、特征和优点将变得显而易见。但是，应当理解，尽管指出 了具体实施方案，但详细描述和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为由于该详细描 述，在本发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
[0019] 附图简述 下述附图构成了本说明书的一部分，并且包括以进一步证实本公开内容的某些方面。 通过参考与本文呈现的具体实施方案的详细描述组合的这些附图中的一个或多个，公开内 容可以得到更好理解。
[0020] 图1 - 1573人源化抗体的SEC分析。
[0021] 图2 -使用胺偶联方法将捕获抗体固定至CM5芯片。分别生成9200 RU抗小鼠 FC IgG信号(上图)和6400 RU抗人FC IgG (下图）。运行缓冲液是HBS-EP运行缓冲液：10 mM HEPES，pH 7. 4,150 mM NaCl、3. 4 mM EDTA、0. 005% 表面活性剂 P20。
[0022] 图3-人aPC与1573抗体结合的SPR传感图：将人aPC分别以0、1.25、2. 5、5、10、 20 nM的浓度以30 μ 1/分钟注射到1573抗体上，共180 s的结合相和500 s的解离相。
[0023] 图4 - cyno aPC与1573抗体结合的SPR传感图：将cyno aPC分别以0、5、10、20、 40、80 nM的浓度以30 μ 1/分钟注射到1573抗体上，共180 s的结合相和420 s的解离 相。
[0024] 图5 -人PC和aPC的1573人源化抗体结合ELISA。
[0025] 图6 -猴PC和aPC的1573人源化抗体结合ELISA。
[0026] 详述 本公开内容涉及单克隆抗体的开发，所述单克隆抗体与活化蛋白C选择性结合，但不 与未活化的蛋白C结合，并且特异性抑制活化蛋白C的抗凝活性。
[0027] 适当时，以单数使用的术语还包括复数，并且反之亦然。在下文所述的任何定义与 该单词在任何其他文件包括引入本文作为参考的任何文件中的用法相冲突的情况下，下文 所述的定义应始终为主用于解释本说明书及其相关权利要求的目的，除非明确指出相反含 义(例如在其中该术语最初使用的文件中）。"或"的使用意指"和/或"，除非另有说明。本 文"一个/ 一种"的使用意指"一个或多个/ 一种或多种"，除非另有说明，或在"一个或多个 / 一种或多种"的使用明显不合适之处。"包含（comprise、comprises、comprising)"、"包 括（include、includes和including)"是可互换的且是非限制性的。例如，术语"包括"应 意指"包括但不限于"。
[0028] 如本文使用的，术语"蛋白C"或"PC"指以其酶原形式的蛋白C的任何变体、同种 型和/或物种同系物，其由细胞天然表达且存在于血浆中，并且不同于活化形式的蛋白c。
[0029] 如本文使用的，术语"活化蛋白C"或"aPC"指活化形式的蛋白C，其特征在于由于 凝血酶切割位点，蛋白C中存在的12氨基酸活化肽的去除和不存在。
[0030] 如本文使用的，"抗体"指完整抗体及其任何抗原结合片段（即，"抗原结合部分"） 或单链。该术语包括全长免疫球蛋白分子(例如IgG抗体)，其是天然存在的或通过正常免疫 球蛋白基因片段重组过程形成的，或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如保留特异性结 合活性的抗体片段。与结构无关，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。例如，抗aPC 单克隆抗体片段与aPC的表位结合。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。 在术语抗体的"抗原结合部分"内涵盖的结合片段的例子包括（i )Fab片段，由\、VH、CjP Chi 结构域组成的单价片段；（ii)F(ab'）2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段 的二价片段；（iii)由V#PC H1结构域组成的Fd片段；（iv)由抗体单臂的VjP VHg构域组 成的Fv片段，（V)由Vh结构域组成的dAb片段（Ward等人，（1989) Nature 341:544-546); (vi)经分离的互补决定区（⑶R);(vii)微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体和κ体(参见例 如 Ul 等Protein Eng 1997 ;10:949_57) ; (viii)骆驼 IgG ;和（ix) IgNAR。此外，尽 管Fv片段的两个结构域八和V油分开基因编码，但它们可以使用重组法通过合成接头进 行连接，所述合成接头使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中 '和Vh区配对以形成单价 分子(称为单链 Fv (scFv);参见例如，Bird 等人（1988) 5bi<9/?c<9 242:423-426 ;和 Huston 等人（1988)他以.JcaiZ 5bi. ?/说85:5879-5883)。此类单链抗体也意欲包含在 术语抗体的"抗原结合部分"内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段， 并且以与完整抗体相同的方式就效用分析片段。
[0031] 此外，考虑抗原结合片段可以包含在抗体模拟物中。如本文使用的，术语"抗体模 拟物"或"模拟物"意指显示出类似于抗体的结合，但为更小的替代抗体或非抗体蛋白质的 蛋白质。此类抗体模拟物可以包含在支架中。术语"支架"指用于改造具有定制功能和特 征的新产品的多肽平台。
[0032] 如本文使用的，术语"抗aPC抗体"指与aPC的表位特异性结合的抗体。当在体内 与aPC的表位结合时，本文公开的抗aPC抗体增强凝血级联的一个或多个方面。
[0033] 如本文使用的，术语"抑制结合"和"阻断结合"（例如提及aPC底物与aPC结合的 抑制/阻断）可互换使用，并且涵盖蛋白质与其底物的部分和完全抑制或阻断两者，例如抑 制或阻断至少约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、 约96%、约97%、约98%、约99%或约100%。如本文使用的，"约"意指所示数值的+/- 10%。
[0034] 提及aPC底物与aPC结合的抑制和/或阻断，术语抑制和阻断还包括与不接触抗 aPC抗体的aPC相比较，当接触抗aPC抗体时，aPC与生理底物的结合亲和力的任何可测量 的减少，例如aPC与其底物包括因子Va或因子VIIIa的相互作用阻断至少约10%、约20%、 约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99% 或约100%。
[0035] 如本文使用的，术语"单克隆抗体"或"单克隆抗体组合物"指单一分子组合物的抗 体分子的制剂。单克隆抗体组合物展示对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。相应地， 术语"人单克隆抗体"指展示单一结合特异性的抗体，其具有衍生自人种系免疫球蛋白序列 的可变区和恒定区。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如 在体外通过随机或定点诱变或者在体内通过体细胞突变引入的突变)。
[0036] 如本文使用的，"经分离的抗体"意指实质上不含其他生物分子的抗体，包括具有 不同抗原特异性的抗体(例如与aPC结合的经分离的抗体实质上不含结合除aPC外的抗原 的抗体)。在一些实施方案中，经分离的抗体是按干重计至少约75%、约80%、约90%、约95%、 约97%、约99%、约99. 9%或约100%纯的。在一些实施方案中，纯度可以通过诸如下述的方 法进行测量：柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。然而，与人aPC的表位、同种型或 变体结合的经分离的抗体可以与例如来自其他物种(例如aPC物种同系物)的其他相关抗原 具有交叉反应性。此外，经分离的抗体可以实质上不含其他细胞材料和/或化学品。如本 文使用的，"特异性结合"指与预定抗原的抗体结合。通常，显示出"特异性结合"的抗体以 至少约IO 5 M4的亲和力与抗原结合，并且以比其对于无关抗原(例如BSA、酪蛋白）的结合 亲和力更高，例如大至少两倍的亲和力与该抗原结合。短语"识别抗原的抗体"和"对于抗 原特异性的抗体"在本文中与术语"与抗原特异性结合的抗体"可互换使用。
[0037] 如本文使用的，术语"最低限度结合"指不与指定抗原结合和/或对指定抗原显示 出低亲和力的抗体。通常，与抗原具有最低限度结合的抗体以低于约IO 2 M^1的亲和力与该 抗原结合，并且不以比它与无关抗原结合的更高亲和力与预定抗原结合。
[0038] 如本文使用的，术语关于抗体例如IgG抗体的"高亲和力"指至少约IO7IT 1的结合 亲和力，在至少一个实施方案中，至少约IO8M4