一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液，即一种稳定的注射制 剂，属于药物制剂技术领域。
【背景技术】
[0002] 干扰素是由灭活的或活的病毒作用于易感细胞后，由易感细胞基因组编码而产生 的一组糖蛋白。其活性及抗原性皆取决于分子中的蛋白质，而与其糖基无关。根据其来源 和结构，可将IEN分为IFN-a、IFN-0、IFN_y、IFN-A S，它们分别由白细胞、纤维母细胞和 活化T细胞产生。IFN-a为多基因产物，有十余种不同亚型，但它们的生物活性基本相同。 IFN除有抗病毒作用外，还有抗肿瘤、免疫调节、控制细胞增殖及引起发热等作用。目前临床 上使用的干扰素大多是通过基因重组技术得到的。
[0003] 为提高天然干扰素的活性，美国Amgen公司首次合成了一种非天然的干扰素 (Consensus interferon,集成干扰素，商品名为干复津）。干复津是一种经计算机优化组 合的非天然的重组a-干扰素，其序列由20种天然a-干扰素亚型序列优化组合而成，其 抗病毒活性比天然干扰素提高了 5~10倍。
[0004] 与其它蛋白一样，使用a干扰素作为药物通常受到一些缺点的限制，包括抗原性 和半衰期较短，其抗原性导致中和抗体的形成以及临床响应的损失，半衰期较短意味着需 要频繁给药以维持蛋白质的治疗有效浓度。这些问题可以通过将干扰素与聚合物如聚乙二 醇缀合来克服。然而，尽管干扰素-聚乙二醇缀合物在临床上有效，但是该类缀合物在临床 实践中的广泛使用，需要能够在一段储运时间内稳定存在，以便利于在使用时的安全有效， 因此需要制成利于储存的稳定制剂。
[0005] 美国专利6180096公开聚乙二醇化干扰素a缀合物注射液在储存中可导致PEG 与干扰素a性质和缀合度的改变。这些改变包括缀合物降解（或称"结构断裂"）成游离 PEG和干扰素a，接着游离的PEG连接至另一个聚乙二醇化干扰素分子上，或PEG分子从 缀合物的一个位点经分子内位移转移至相同分子内的另一个位点，解决这种降解问题是将 PEG干扰素a缀合物制成冻干制剂。W01999/048535、W02006/020720也公开了一种类似的 以冻干形式解决降解问题的方案。
[0006] 聚乙二醇化重组人集成干扰素变异体的氨基酸序列具有特殊性（见专利 ZL01102915.3)，在常规的集成干扰素N末端添加了若干氨基酸（GSGGG)，并通过对末 端氨基酸（甘氨酸，G)的氨基进行单一位点的聚乙二醇化修饰，对其溶液的研宄发现结 构断裂通常发生在上述添加的N末端的GSGGG序列中（包括PEG连接位点处）。专利 CN201110189858. 3中公开了一种聚乙二醇化集成干扰素变异体注射液，处方中包括缓冲 液、山梨醇、聚山梨酯80，pH为4. 5-7. 5,其中在断裂片段研宄中，储存过程最为稳定的是以 磷酸盐缓冲液（缓冲的pH为6. 5-7. 5)而配置的稳定注射溶液，该配方在储存过程中结构 断裂后的游离IFN-SA片段也在5. 4%以上。
[0007] 然而，影响聚乙二醇化重组集成干扰素变异特注射液稳定性的因素，不仅仅是只 有结构断裂这一种，干扰素类产品发生氧化降解已有很多报道，聚乙二醇化重组人集成干 扰素变异体的氨基酸序列中同时含有若干个甲硫氨酸（M)，因此理论上可能发生氧化降解。 并且在长期或加速稳定性研宄中证实，氧化杂质的增加也是注射液纯度下降的主要原因。
[0008] 显然，在有众多影响注射液稳定的因素中，仅结构断裂后产生的游离片段就存在 如此多的降解片段对产品的质量显然是很不利的，因此需要提供一种在长期储存过程中更 为稳定、降解杂质含量更少的聚乙二醇化重组集成干扰素变异体注射液。
[0009] 发明目的
[0010] 本发明的目的是提供一种长期储存过程中降解杂质更为少的稳定的聚乙二醇重 组集成干扰素变异体注射剂。
[0011] 研宄人员在制剂研宄过程中惊奇地发现，用组氨酸盐为缓冲剂，并将溶液的pH控 制在6. 0以下（如4. 5-6. 0)，更为优选地将pH控制在5. 5以下（如5. 0-5. 5)，在制剂储存 过程中可以更为有效地控制制剂中的断裂片段及氧化降解杂质的形成。
[0012] 本发明描述的稳定的制剂处方在长期储存过程中（4°C下，18个月），可以将断裂 片段控制在5%以下，优选的是控制在3%以下，1 %以下，或者0. 5%以下，更为优选地是控 制在0. 1%以下，相对于201110189858. 3专利中的注射制剂片段含量显著降低，对制剂的 质量可以明显提高。此外，还可将氧化杂质控制在3%以下，更优选为控制的2%-下，最优 选为控制在1.5 %以下。
[0013] 具体地，本发明涉及一种聚乙二醇集成干扰素变异体的稳定溶液配方，所述稳定 溶液包括：治疗有效量的聚乙二醇集成干扰素变异体、组氨酸、保护剂及稳定剂，所述溶液 的 pH 为 4. 5-6. 0,优选为 5. 0-6. 0。
[0014] 本发明稳定溶液中，所述组氨酸的浓度可以是5-50mmol/L的任意范围，优选地， 5-10mm 〇l/L的组氨酸即可实现本发明的目的，更大浓度的组氨酸虽然可能更有利于聚乙二 醇集成干扰素注射液的稳定，但更大的浓度实现更稳定的效果已经不那么显著，却会增加 制剂成本。
[0015] 本发明中，保护剂可以是选自糖类，如山梨醇、蔗糖、葡萄糖、甘露糖、葡聚糖、海 藻糖，或者是氯化钠，优选为山梨醇、蔗糖或海藻糖，更优选山梨醇，保护剂的浓度可以是 1 % -15% (重量/体积，g/100ml溶液）。
[0016] 本发明中，所述的稳定剂选自聚山梨酯类，如聚山梨酯20或聚山梨酯80,优选为 聚山梨酯80,所述稳定剂的浓度为0.001%-0.01% (重量/体积，g/100ml溶液）。
[0017] 本发明中，所述稳定溶液的pH为4. 5-6. 0,优选为5. 0-6. 0,更优选为5. 0-5. 5。
[0018] 进一步地，为更好地控制聚乙二醇集成干扰素变异体溶液在长期储存过程中因氧 化而导致质量下降，本发明所述稳定溶液还可以包括至少一种选自甲硫氨酸、硫代硫酸钠、 亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、EDTA、维生素C或二丁基苯酚的抗氧剂，优选为甲硫氨酸，所述抗氧 剂的浓度为〇? 01 % -〇? 5% (重量/体积，g/100ml溶液）。
[0019] 在本发明的一实施方式中，涉及一种如下组成的聚乙二醇集成干扰素变异体溶 液，包括：50-500 y g/ml的聚乙二醇化集成干扰素变异体、5-50mmol/L的组氨酸、重量体积 比为1% -10 %的山梨醇、重量体积比为0. 001% -0. 005 %的聚山梨酯80、重量体积比为 0? 05% -0? 15%的甲硫氨酸，所述稳定溶液的pH为5. 0-6. 0。
[0020] 在本发明的一实施例中，通过对不同保护剂考察，发现当选用氯化钠时，是不利于 制剂稳定的，储存过程中有更多的断裂片段，山梨醇及蔗糖相对更少。
[0021 ] 在本发明的又一实施例中，选用不同的缓冲系统来评价其对制剂稳定性的影响， 在同样的pH条件下，发现醋酸盐缓冲系统不利于控制制剂的断裂情况，而磷酸盐缓冲系统 缺有更多的氧化杂质形成，然而，组氨酸盐缓冲系统（也可称为组氨酸缓冲系统，通过用盐 酸或氢氧化钠调控最终制剂的pH值）对制剂的中的片段断裂及氧化杂质的控制更为有利。
[0022] 在本发明的又一实施例中，在选中组氨酸盐作为制剂的缓冲系统后，通过考察不 同pH值对制剂稳定性影响，发现高pH(比如6. 7,或7. 2以上），对制剂的片段断裂及氧化 杂质的控制都不利，而将pH控制在6. 0或以下，可以更为有效地控制制剂中的片段断裂及 氧化杂质的形成。优选的是，当将pH控制在5. 5时，其对制剂的稳定性又更为有利。
[0023] 在一更具体的实施例中，涉及一种如下组成的聚乙二醇集成干扰素变异体溶液， 包括：权利要求8所述的稳定溶液，所述溶液包括150 y g/ml的聚乙二醇化集成干扰素变异 体、10mmol/L的组氨酸、重量体积比为4 %的山梨醇、重量体积比为0. 004 %的聚山梨酯8