超声前体的制备方法
【专利说明】超声前体的制备方法 发明领域
[0001] 本发明涉及制备包含磷脂稳定的全氟丁烷微泡的超声造影剂前体的方法。所述方 法顺从工业规模生产，并且提供所述微泡的更一致的瓶与瓶产率（Vial-to-vial yield)和 尺寸分布。还提供使用本发明的方法制备试剂盒和超声造影剂的方法。
【背景技术】
[0002] 基于全氟化碳（例如，全氟丙烷或全氟丁烷）的磷脂稳定的微泡的超声造影剂在 本领域中熟知[参见，例如 Wheatley 等，J. Drug Del. Sci. Technol.，23(1)，57-72 (2013)]。
[0003] WO 97/29782教导了在室温下稳定的超声造影剂前体可通过在选自蔗糖、麦芽糖、 海藻糖、棉子糖或水苏糖（优选蔗糖）的冷冻-干燥稳定剂存在下冻干全氟化碳微泡来制 备。
[0004] W0 99/03558公开了选择超声造影气体微泡形成多分散混合物以获得具有紧凑尺 寸分布（即，单分散性）的这类微泡的方法。所述方法包括浮选和再悬浮。
[0005] W0 99/08715公开了制备包含含气体囊泡的水性分散体的药物组合物的方法，所 述囊泡的膜包含两亲性成膜材料，所述方法包括： (i) 由包含两亲性成膜材料的混合物产生含气体囊泡的液体分散体； (ii) 冻干所述含气体囊泡的液体分散体； (iii) 用无菌水性液体重构步骤（ii)的冻干产物以生成含气体囊泡的水性分散体； 和 (iv) 处理步骤（i)或步骤（iii)的水性分散体产物或步骤（ii)的冻干产物以生成含 气体囊泡的基本无聚集物的无菌水性分散体。
[0006] W0 99/08715教导了在步骤⑴和步骤（ii)之间的时间应该减至最少，以抑制微 泡团聚形成不想要的较大物质。然而，W0 99/08715没有教导在冻干之前应该对含气体囊 泡进行尺寸控制，以及在冻干步骤或在批量生产过程中分配到多个单个小瓶中之前必须使 用防冻剂/冻干保护剂。
[0007] EP 1228770 A1教导了制备包含气体微泡的冻干的超声造影剂的方法，其中冻干 的前体的小瓶在减小的顶空气体压力下密封。据说该减压有助于控制在重构前体小瓶后形 成的水性微泡组合物中的粒度。
[0008] W0 2004/069284解决了得到具有限定尺寸分布的磷脂稳定的气体微泡超声造影 剂的问题。W0 2004/069284教导了在冻干之前在微泡制备乳液中应该使用与水基本不混溶 的有机溶剂。W0 2004/069284教导了在重构冻干的前体后得到的微泡具有相对较小的直径 和窄尺寸分布。
[0009]Solis等[Int. J. Pharmaceut.，396(1-2)，30-38 (2010)]研宄了赋形剂（包括冻 干保护剂）对冻干的全氟丙烷微泡前体的影响。他们得到的结论是，葡萄糖是最好的冻干 保护剂，紧接着是海藻糖，这两者均优于蔗糖或甘露糖醇。
[0010] Feshitan 等[J. Coll. Interf. Sci.，329，316-324 (2009)]报道，与表面活性剂 涂覆的微泡形成对比，脂质涂覆的微泡在离心之后稳定，并且脂质壳粘性高且相对不透气。 Feshitan等报道在4-5 y m尺寸范围内的全氟丁烷微泡稳定至少2天，但在2周后趋于崩解 成较小尺寸的微泡（1-2 ym)。
[0011] 仍然需要能够控制造影剂的微泡浓度和尺寸分布、产率和其它重要特性的瓶与瓶 变化的超声冻干前体制备方法。所述方法需要顺从工业规模生产，并获得具有满足规章要 求（例如，美国药典和国际协调会议指南（ICH Guidelines))的小瓶含量和安全性特性的 均一性的前体产物。
【发明内容】
[0012] 发明概述 例如超声处理和高剪切乳化的常规微泡超声造影剂制备方法提供良好的产率和低成 本生产。当容量规模扩大到工业生产时，它们具有难以控制微泡的尺寸分布的缺点。虽然 已经开发了容许制备具有紧凑尺寸分布的这类微泡的其它制备技术，但这些备选方法的产 率较低，涉及高成本设备或太慢而无法扩大规模到工业生产方法。
[0013] 本发明寻求提供顺从工业规模生产、但对造影剂的微泡浓度、尺寸分布、产率和其 它重要特性的瓶与瓶变化也给予足够控制的方法。
[0014] 本发明人发现，在上千个微泡造影剂小瓶的批量生产中，两个关键参数对于控制 变化性是重要的：（a)在冻干之前的微泡的尺寸范围；和（b)在分配到指定小瓶与将小瓶 内含物在-40°C至-70°C下冷冻之间经过的时间（"停留时间（holding time)"）。
[0015] 本发明提供了控制这两参数的方法，随之而来的优势是： (i) 在每个小瓶中最佳微泡产率和浓度； (ii) 对瓶与瓶含量的均一性的控制。
[0016] 还发现本发明的造影剂前体对多价阳离子不太敏感。
[0017] 不希望受理论约束，本发明人认为，由于在液体基质（例如，蔗糖溶液）和充气微 泡之间的高密度增量，微泡趋于快速分离到液体体积的顶部（"乳脂化（creaming)"）。必 须使该乳脂化减至最小并对其加以控制，从而提供上述益处（i)和（ii)。认为很可能表面 层中高浓度的微泡在冻干期间削弱了饼的干燥，和/或太高的局部浓度减少了微泡的生存 率，因为它们被部分地捕集在最终蔗糖结构的外侧，即表面中的孔，而不是完全包埋在气囊 (gas pocket)中。
[0018] 发明详述 在第一方面，本发明提供了制备包含由氢化卵磷脂酰丝氨酸稳定的全氟丁烷微泡在蔗 糖中的冻干组合物的超声造影剂前体的方法，其中所述方法包括： (i) 提供所述由氢化卵磷脂酰丝氨酸稳定的全氟丁烷微泡在水性溶液中的水性悬浮 液； (ii) 将所述微泡的尺寸调节到在2-5Mm范围内的中值尺寸； (iii) 用无菌水性蔗糖溶液稀释来自步骤（ii)的调好尺寸的悬浮液以获得5-20% w/ v的最终蔗糖浓度； (iv) 将来自步骤（iii)的组合物的等分试样分配到小瓶中以获得填充的小瓶； (V)在完成步骤（iv)的分配之后在小于5分钟的停留时间段内，将各个这样填充的小 瓶冷却到-40 °C至-70 °C的温度； (vi) 根据需要重复步骤（iv)和（V)，直到已得到所需数目的冷却的填充的小瓶； (vii) 冷冻干燥来自步骤（v)和（vi)的冷却的填充的小瓶； (viii) 用全氟丁烷回填在来自步骤（vii)的冷冻干燥的小瓶中的顶空气体； (ix) 用封盖件密封来自步骤（viii)的小瓶。
[0019] 术语"造影剂"具有其在体内医学成像领域中的常规含义，并且是指以适合哺乳动 物施用的形式的试剂，与通过仅使哺乳动物受试者成像得到的图像相比，其有助于提供在 目标区域或器官中的更清晰的图像。术语"受试者"是指哺乳动物体内，优选完整哺乳动物 体内，且更优选活着的人类受试者。短语"以适合哺乳动物施用的形式"意指如下组合物， 其无菌，无热原，没有产生毒性或副作用的化合物并且在生物相容的pH(约pH 4.0-10. 5) 下配制。所述组合物没有会导致体内栓塞的危险的微粒，并配制成在与生物流体（例如，血 液）接触时不会发生沉淀。所述组合物还仅含有生物相容性赋形剂，且优选为等渗的。
[0020] 正如其它体内成像剂，造影剂设计成对欲成像的哺乳动物受试者具有最小的药理 学影响。优选造影剂可以侵袭性最低的方式，即在专业医疗专家实施时对哺乳动物受试者 没有明显健康危险的情况下，对哺乳动物身体施用。这种侵袭性最低的施用优选静脉内施 用到所述受试者的周边静脉，而不需要局部或全身性麻醉。
[0021] 术语"微泡"具有其在体内超声成像领域中的常规含义，并且是指通常在0.5 ym 和10 ym之间的直径的气体微泡。在高于7 ym的尺寸下，存在在肺毛细管中明显的滞留 危险（栓塞）。所述微泡的尺寸与红血细胞类似，这允许它们在遍及哺乳动物身体的微血 管和毛细管中显示出类似的特征[Sirsi等，Bubble Sci.Eng.Technol.，1(1-2)，3-17 (2009)]〇
[0022] 本发明的合适微泡如Sirsi等（上文）描述由磷脂壳或涂层、尤其是在氢化卵磷 脂酰丝氨酸（H-EPS)中存在的磷脂稳定。在H-EPS中存在的磷脂主要是磷脂酰丝氨酸和磷 脂酸[Hvattum 等，J. Pharm. Biomed. Anal.，42，506-512 (2006) ] 〇
[0023] 全氟丁烷（"PFB"）具有其标准化学含义，并且在医学用途的情况下也称为全氟丁 烷（perflubutane)。全氟正丁烷的化学式为CF 3CF2CF2CF^ C 4F1Q，沸点为-2. 2°C。商品全 氟正丁烷含有少量（通常2-4%)的全氟异丁烷异构体，即CF3CF (CF3) CF3。
[0024] 术语"水性悬浮液"是指微泡在水性溶剂中的悬浮液，该水性溶剂包括水和/或与 水混溶的溶剂。该水性溶剂优选为生物相容性载体。术语"生物相容性载体"是指使组