支原体疫苗的制备方法
【专利说明】支原体疫苗的制备方法
【背景技术】
[0001] 支原体（Mycoplasma)属菌属于柔膜菌纲（Mollicutes)且代表一组源自厚壁菌门 (Firmicutes)谱系之生物体。柔膜菌纲系最小自主复制生物体，其在结构上与其它真细菌 之不同之处在于其缺少细胞壁。业内认为其单膜表面系在复杂免疫活性宿主环境中介导适 应及存活之关键界面。此外，柔膜菌纲具有小基因组及数目有限之代谢路径。因此，亦将支 原体属成员描述为"最小自我复制生物体"。然而，尽管其非常简单，多种支原体菌系人类及 多种动物之病原体。与其它毒力主要取决于毒素、侵袭素及细胞溶素之病原性细菌相比，病 原性支原体菌似乎不具有该等典型主要毒力因子（Chambaud，I.等人，2001，Nucleic Acids Res. 29:2145-2153, Fraser 等人，1995, Science 270:397-403)。目前可获得之对允许病原 性支原体引起宿主细胞损伤、发炎及疾病之分子机制及效应物之了解极少。
[0002] 病原性支原体菌主要引起人类及动物之非典型肺炎、泌尿生殖道感染及 关节炎（Blanchard, A?及 G.F.Browning(编辑）.2005.Mycoplasmas:Molecular biology, pathogenicity and strategies for control. Horizon Bioscience, ffymondham U. K. ；Kobisch M.及 Friis N. F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605)。已知该等体征之再活化或加重会反复并逐渐转变成慢性疾病， 且因此通过早期诊断及早期治疗预防或治疗加重或再活化非常重要。猪肺炎支原体 (M. hyopneumoniae)系地方性肺炎之病因。在猪中，其因体重增长降低及饲料效率低而系 最常见且经济上最重要之疾病之一。该疾病引起肺损害、慢性咳嗽、毛色无光、生长迟滞及 持续数周之不兴旺外观。肺损害、尤其在腹侧顶叶及心叶中之损害之特征在于上皮细胞增 生及单核细胞之血管周及细支气管周累积增加。猪呼吸道之另一常见支原体，即猪鼻支原 体（M. hyorhinis)可引起仔猪之多发性衆膜炎及关节炎。猪滑液支原体（M. hyosynoviae) 一般位于扁桃体中且可引起关节炎疾病，从而导致经济损失。猪滑液支原体系自关节及咽 /扁桃体样品分离且可在血液及关节液中诱导抗体。牛支原体（M.bovis)被认为系致病性 更强之支原体菌中之一且在世界上造成显著经济损失。支原体菌引起所有年龄之牛之严重 临床体征。牛支原体系发现引起牛之肺炎、乳腺炎及关节炎之最常见支原体病原体，且其病 因学作用与母牛及公牛之耳炎、角膜结膜炎、滑膜炎及生殖障碍有关。
[0003] 由于支原体缺少细胞壁，许多靶向细胞壁合成之常见抗生素（例如青霉素或其它 0 _内酰胺抗生素）对其无影响。实际使用之支原体感染之治疗剂系一些抗生素，例如基于 大环内酯或基于新喹诺酮或基于四环素之抗生素，但该等抗生素具有严重不良效应，例如 抗药性菌株之出现，其导致支原体感染变严重同时预期治疗效应不足，且成为转变成慢性 疾病的病因。此外，疫苗接种系控制支原体感染之有效方法。然而，通常仅在复合培养基中 培养才可获得制备疫苗所需之支原体之极高产率（Kobisch M.及Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605 ；Gabridge M. G.等人， 1976, Cultivation of mycoplasma in a modified tissue culture medium, Applied and Environmental microbiology. 31, 986-989 ；Sotoodehnia A.等人 2007, Preparation of agalactia vaccine in fermentor, Archives of razi institute, 62, 45-48 ;Dahlia等人， 2009Isolation of mycoplasma hyosynoviae from penumonic lung of swine, Tropical Biomedicine 26:341-345)。取决于欲培养之支原体菌，复合培养基补充有10-30%血清且 有时补充有酵母提取物。因此，由于血清之高价格，培养支原体菌之成本密集。此外，减少 复合培养基中之血清亦将有益于动物福利。因此，业内需要以极高产率在低血清培养系统 中培养支原体，以供制备有效预防支原体感染之免疫原性组合物。此外，猪特异性支原体菌 一般系在含有猪特异性血清之复合培养基中培养（Kobisch M.及Friis N.F. 1996, Swine mycoplasmoses, Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 15, 1569-1605)。然而，猪特异性血清可含有 其它猪特异性病原体或可含有可使欲制备之免疫原性组合物之免疫原性降低之针对猪特 异性病原体之抗体。因此，业内亦需要以极高产率在无猪血清培养系统中培养支原体，以供 制备有效预防支原体感染之免疫原性组合物。
【发明内容】
[0004] 在阐述本发明各态样之前，必须注意，除非上下文明确指示其它含义，否则如在本 文中及在随附申请专利范围中使用之单数形式"一（a) "、"一（an)"及"该"包括复数参考。 因此，例如，在提及"一抗原"时包括复数种抗原，在提及"细胞"时系指一或多个细胞及本 领域技术人员已知之其等效物，等等。除非另有定义，否则本文中所使用之所有技术及科学 术语皆具有熟习本发明所属领域技术者一般理解之相同意义。尽管在本发明之实践或测试 中可使用任何与本文所述之方法及材料类似或等效之彼等，但现在阐述较佳方法、装置及 材料。本文所提及之所有出版物皆系以引用方式并入本文中，用于阐述及揭示该等出版物 中所报导可结合本发明使用之细胞系、载体及方法之目的。本文中所有内容皆不应视为承 认该揭示内容由于先前发明而有资格先于本发明。
[0005] 本发明解决先前技术中固有之问题并提供技术现况之独特进步。
[0006] 概言之，本发明提供制备用于治疗及/或预防对象之支原体感染之免疫原性组合 物之方法，其包含a)在低血清真核细胞系统中培养支原体菌；b)获得该支原体菌之抗原； 及c)添加医药上可接受之载体。
[0007] 有利地，本发明所提供实验数据揭示，可在低血清真核细胞系统中产生支原体菌。
[0008] 术语"免疫原性组合物"系指包含至少一种抗原之组合物，其引发被施用该免疫原 性组合物之宿主之免疫反应。该免疫反应可为细胞及/或抗体介导之针对本发明免疫原性 组合物之免疫反应。该宿主亦被称为"对象"。较佳地，本文所阐述或提及之任一宿主或对 象系动物。
[0009] 通常，"免疫反应"包括（但不限于）以下效应中之一或多者：特异性指向本发明 免疫原性组合物中所包括抗原之抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞及/或细胞毒 性T细胞及/或y - S T细胞之产生或活化。较佳地，宿主将展示保护性免疫反应或治疗反 应。
[0010] "保护性免疫反应"将显示为受感染宿主通常展示之临床体征之减少或缺少、较短 回复时间及/或缩短之感染性持续时间或组织或体液或受感染宿主之排泄物中降低之病 原体效价。
[0011] 若宿主展示保护性免疫反应而使得对新感染之抗性将增强及/或疾病之临床严 重度降低，则将免疫原性组合物称为"疫苗"。
[0012] 如本文所用"抗原"系指（但不限于）引发宿主对包含该抗原或其免疫活性组份 之所关注免疫原性组合物或疫苗之免疫反应之组份。抗原或免疫活性组份可为完整微生物 (呈灭活或改良活形式）或其任何碎片或部分，若将其施用宿主可引发宿主之免疫反应。抗 原可为或可包含呈其原始形式或作为所谓改良活疫苗（MLV)中之减毒生物体之完整的活 生物体。抗原可进一步包含该等生物体之适当组件（亚单位疫苗），其中该等组件系通过以 下方式来生成：破坏完整生物体或该等生物体之生长培养物且实施后续纯化步骤以产生期 望结构；或通过对适宜系统（如但不限于细菌、昆虫、哺乳动物或其它物种）进行适当操作 来诱导合成过程，且随后视情况实施分离及纯化程序；或通过使用适宜医药组合物在需要 疫苗之动物中直接引入遗传物质来诱导该等合成过程（多核苷酸疫苗接种）。抗原可包含 所谓的死菌疫苗（KV)中之通过适当方法灭活之完整生物体。若生物体系细菌，则死菌疫苗 称为死菌苗（bacterin)。
[0013] 术语"治疗及/或预防"系指减小畜群中具体支原体感染之发病率或降低由具体 支原体感染引起或与该感染相关之临床体征之严重度。因此，术语"治疗及/或预防"亦系 指减小畜群中受具体支原体菌感染之动物数（=减小具体支原体感染之发病率），或与动 物未接受如本文所提供免疫原性组合物之动物组相比，在动物已接受有效量之该免疫原性 组合物之动物组中降低通常与支原体感染相关或由该感染引起之临床体征之严重度。
[0014] "治疗及/或预防"一般涉及向需要或可受益于此治疗/预防之对象或对象群施用 有效量之本发明免疫原性组合物。术语"治疗"系指一旦对象或畜群中之至少一些动物已 被该支原体感染且其中该等动物已显示一些由该支原体感染引起或与该感染相关之临床 体征，则施用有效量之免疫原性组合物。术语"预防"系指在对象之任何支原体感染之前， 或至少在该动物或动物组中没有动物不显示任何由该支原体感染引起或与该感染相关之 临床体征时，向该对象施用。
[0015] 如本文所用术语"有效量"意指（但不限于）引发或能引发对象之免疫反应之抗 原之量。该有效量能减小畜群中具体支原体感染之发病率或降低具体支原体感染之临床体 征之严重度。
[0016] 较佳地，与未经治疗或经在本发明之前可获得之免疫原性组合物治疗但随后被具 体支原体菌感染之对象相比，临床体征之发病率或严重度减小至少10%、更佳至少20%、 更佳至少30%、甚至更佳至少40%、更佳至少50%、甚至更佳至少60%、更佳至少70%、甚 至更佳至少80 %、更佳至少90 %且最佳至少95 %。
[0017] 如本文所用术语"临床体征"系指对象来自支原体菌之感染体征。感染之临床体 征取决于所选病原体。该等临床体征之实施例包括（但不限于）呼吸窘迫、多发性浆膜炎 (例如腹膜炎、肋膜炎、心包炎）、关节炎（跛行及关节肿胀）、耳炎、被毛粗化、微热、抑郁症、 食欲下降及菌血症。然而，临床体征亦包括（但不限于）可自活动物直接观察到之临床体 征。可自活动物直接观察到之临床体征之实施例包括鼻排出物及眼分泌物、嗜睡、咳嗽、喘 鸣、膈痉挛性呼吸（thumping)、高热、体重增加或减少、脱水、腹泻、关节肿胀、跛行、消瘦、皮 肤苍白、羸弱、腹泻及诸如此类。
[0018] 可通过向有需要对