的测定 包括悬尾试验、强迫游泳试验、高价十字迷宫和糖水偏爱实验。所有的行为学测试均在安静 的环境下进行，隔离外界噪音。（1)悬尾实验：悬尾实验是一种经典而又能快速评价抗抑郁 药物、兴奋药物、镇静药物药效的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱， 从而放弃挣扎，进入特有的不动状态，实验过程中记录小鼠不动时间来反映抑郁状态，即小 鼠不动时间越长表明抑郁状态越明显。本实验是将小鼠尾尖固定于绳子上使其呈倒挂悬空 状，垂直距离距台面约30cm，对小鼠活动进行录像，观察各组小鼠5min内的活动情况，统计 其不动时间。悬挂时小鼠顺从或者静止不动视为不动状态。（2)强迫游泳试验：强迫游泳 实验是一种经典而又能快速评价抗抑郁类药物药效的方法。其原理是小鼠在游泳过程中记 录漂浮时间来反应抑郁状态，即小鼠游泳不动时间越长，表明抑郁状态越明显。本实验是将 小鼠置于装有水温为23±2°C及水深为20cm的5000mL大烧杯中，对小鼠游泳过程进行录 像，观察5min内小鼠的游泳情况，统计5min内小鼠游泳不动的时间。小鼠仅将头部露出 水面而处于漂浮状态以致不被淹死的持续时间，即被判定为不动时间。每只小鼠进行游泳 试验一次，每次试验后换水，排除尿液、粪便、皮毛的干扰。（3)糖水偏爱实验：小鼠提前适 应两个水瓶的饮水环境，之后再适应两瓶分别装有普通水和2%蔗糖水的饮水环境，每天上 午十点测定水瓶的整体重量，12h后调换水瓶的位置，并于24h后再次测定水瓶的重量，并 计算糖水偏嗜率。（糖水偏嗜率（％)=糖水消耗量/总液体消耗量X 100% )。实验数据 以Mean土SEM表示，采用t检验对实验数据进行统计学处理。P < 0. 05被认为存在显著性 差异。如（图2A)所示，在悬尾实验中与正常对照组相比，小鼠水浸拘束负荷后悬尾小鼠 不动时间显著增长（P< 0.01)，而特咖宁低、中、高剂量给药后悬尾不动时间明显减少（P < 0. 05, P < 0. 05, P < 0. 01)。如（图2B)所示，强迫游泳实验中，与正常对照组相比，小 鼠水浸拘束负荷后悬浮小鼠不动时间显著增长（P< 0.01)，而特咖宁中、高剂量给药的水 浸拘束负荷小鼠悬浮时间明显减少（P < 〇. 05)。如（图2C)所示，与正常对照组相比，小鼠 水浸拘束负荷后糖水偏爱率显著降低（P < 0. 01)，特咖宁低、中、高剂量给药的水浸拘束负 荷小鼠糖水偏爱率显著升高（P < 〇. 05,P < 0. 01)。结果提示特咖宁对水浸拘束应激导致 的抑郁样行为具有显著的改善作用。
[0052] 试验例4特咖宁对慢性水浸拘束应激负荷小鼠海马神经递质的影响：慢性水浸拘 束应激及给药方案同实施例3。CWIRS结束后第二天，用乙醚麻醉小鼠，于冰上迅速分离海 马，-80°C冰箱储存备用。小鼠单侧海马加入1001115%高氯酸，于冰浴中进行匀浆。匀浆 液在4°C下以12000r/min离心15分钟，上清液经0. 2 ii m滤膜过滤，经HPLC-ESA检测5-HT 及其代谢产物5-HIAA的含量。利用高效液相库仑阵列色谱电化学检测法（HPLC-ECD)检测 慢性水浸拘束应激小鼠海马中5-HT及其代谢产物5-HIAA的含量。海马称重后加入含3% 高氯酸的PBS溶液使得终浓度为lg/ml，样品于冰浴条件下匀浆30s，于4°C、15000rpm离心 20min，上清液通过0. 2 ii m的滤膜器过滤得到样品。将20 ii L样品注入HPLC-E⑶进行检测。 结论：如（图3A和B)所示，与正常对照组相比，小鼠慢性水浸拘束应激后海马中5-HT含量 显著减少（P < 〇. 〇〇1)，而5-HIAA含量明显增加（P < 0. 01)，特咖宁中、高剂量能显著增加 慢性水浸拘束应激小鼠海马5-HT含量（P < 0. 05, P < 0. 01)，同时显著降低5-HIAA含量 (P < 0. 05, P < 0. 01)，提示特咖宁对应激导致的海马神经递质5-HT代谢紊乱具有显著的 改善作用。
[0053] 试验例5特咖宁对MPTP造成的帕金森模型小鼠纹状体内谷氨酸（Glu)和Y -氨 基丁酸（GABA)释放的影响：冰上剥离小鼠纹状体，置于Iml圆底离心管中并称重，加入 2501110.3%高氯酸去蛋白液，冰浴中组织匀楽机研磨成匀楽，4<€下12000印111离心15111；[11， 上清液经0. 2 m滤膜过滤后取20 进样。ESA-HPLC检测谷氨酸（Glu)和Y _氨基丁酸 (GABA)的含量。如表2所示，MPTP模型组纹状体内GABA含量明显下降，给咖啡因（Ca)及 特咖宁低剂量（Tc-L)和特咖宁高剂量（Tc-H)预处理均能明显提高其含量（P < 0.001，P < 0.0 I，P < 0.0 O1)。同时，MPTP能使GABA/Glu比值明显下降，使GABA与谷氨酸之间的平 衡遭到破坏，而咖啡因（Ca)及特咖宁高剂量（Tc-H)均明显提高GABA/Glu比值（P < 0. 05)， 特咖宁低剂量（Tc-L)则对其无显著影响。提示特咖宁高剂量可以改善MPTP造成的GABA 与谷氨酸之间的平衡失调，从而改善帕金森病小鼠神经元损伤。
[0054] 表2特咖宁（Theacrine)对MPTP造模小鼠纹状体中GABA和GABA/Glu的影响 (Mean土SD，n = 10)
[0055]
[0056]注：###P < 0? 001，与正常组比；*P < 0? 05, **P < 0? 01，***P < 0? 001，与模型组 相比
[0057] 试验例6特咖宁的抗应激作用：本试验检测特咖宁对慢性水浸拘束应激小鼠血浆 中皮质酮（CORT)的影响。采用慢性水浸拘束应激建立小鼠海马神经再生损伤模型，分组 为正常组（Nor)，应激模型组（CWIRS)，氟西汀阳性对照组（Fix，20mg/kg)，咖啡因组（Ca, 20mg/kg)和特咖宁（Tc，20mg/kg)。采用HPLC紫外检测方法测定慢性水浸拘束应激小鼠血 浆中皮质酮的含量。取小鼠全血置于肝素处理过的离心管中，以5000rpm离心5min分离血 浆。取0. 5ml血浆，向其中加入25 ill皮质醇（4 ii g/ml)作为内标，振摇混匀；并添加入2ml 乙酸乙酯振摇萃取，分离得到上层乙酸乙酯液，下层水液再用乙酸乙酯萃取一遍，合并乙酸 乙酯液后用〇. ImlNaOH洗一次，再用蒸馏水洗2次。乙酸乙酯液置于氮气下挥发吹干后加 入100 流动相（乙腈-水：38-72)溶解即得皮质酮分析样品溶液。如图4所示，与正常 对照组相比，小鼠慢性水浸拘束应激后血浆中皮质酮含量显著升高（P < 0. 05)，而特咖宁 能明显降低慢性水浸拘束应激小鼠血浆中皮质酮的含量（P < 〇. 05)，提示特咖宁对心理应 激导致的激素分泌异常具有明显的改善作用。
[0058]试验例7特咖宁对慢性水浸拘束应激小鼠海马齿状回神经元再生的影响：模型 建立及分组同试验例3,慢性水浸拘束应激最后一天，每隔两小时腹腔注射溴化去氧尿苷 BrdU(75mg/kg)，该化合物为胸腺啼陡的类似可以参与到DNA的合成中，用来标记活组织中 增生细胞的量，连续注射6次，保证充分掺入到小鼠脑组织新生成的细胞中。增殖细胞数定 量：将做增殖的鼠脑切片挑选6片，经梯度酒精脱水，孵育抗BrdU和Doublecortin (DCX，标 记未成熟的神经元）