一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物干细胞培养技术领域，特别涉及一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提 取物的制备方法。 技术背景
[0002] γ -氨基丁酸（Gamma Aminobutyric Acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，在医药 行业主要应用其降血压、抗惊厥、镇痛和改善记忆的功效。在化妆品行业中，γ-氨基丁酸 表现出优异的保湿和抗皱功效，广泛用于各种保湿或抗皱化妆品中。
[0003] 将茶鲜叶经过一定时间的厌氧处理会产生γ -氨基丁酸，茶叶中γ -氨基丁酸是 由L-谷氨酸在L-谷氨酸脱羧酶的催化作用下脱酸形成。目前国内外均通过对茶叶鲜叶加 工处理，以提高γ -氨基丁酸含量，主要处理方法有厌氧处理、厌氧好气交替处理、红外线 照射处理、微波照射处理、谷氨酸钠溶液综合处理等方法，处理后的茶中γ -氨基丁酸的含 量在茶叶干重的〇. 15-0. 2%。
[0004] 离体培养的高等植物细胞具有合成天然产物的能力，利用这一特性，可以通过优 化植物干细胞的培养条件，有目的性的使其积累更多的次生代谢产物。刘亚军等人发表的 论文《茶树愈伤诱导及不同儿茶素含量细胞系筛选》，研宄了不同培养条件对茶干细胞中儿 茶素积累量的影响；钟俊辉等人发表的论文《茶愈伤组织培养及其茶氨酸的累积》，研宄了 不同培养条件对茶干细胞中茶氨酸积累量的影响。但迄今还未有研宄关于不同培养条件对 茶干细胞中r-氨基丁酸积累量的影响。
[0005] 当前从经过处理的茶叶鲜叶中获取γ-氨基丁酸单体，通常将加工处理后的茶叶 干燥，然后使用酒精浸出，用大孔离子交换树脂进行提纯，将洗出物使用多次重结晶法获得 纯度在90%以上的γ-氨基丁酸晶体。因为传统方法处理的茶叶鲜叶中γ-氨基丁酸其含 量只有茶叶干重的〇. 15-0. 2%，含量偏低，并且茶叶中含有的叶黄素含量比较高，工业提纯 较为困难，会产生大量有机溶剂废液，对环境不利。
[0006] 如果通过特定优选的茶叶干细胞的培养条件，可以有目的的获得高含量γ -氨基 丁酸的茶叶干细胞，因为茶叶干细胞中并不存在叶黄素，可以使用特定简单的提纯工艺，节 约γ-氨基丁酸提纯成本。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方 法，该方法获得的茶叶干细胞固体粉末中γ-氨基丁酸茶叶提取物含量较高，γ-氨基丁酸 茶叶提取物得率高，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量高的优点。
[0008] 本发明通过以下技术方案实现：一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方 法，其特征在于包括以下步骤： Α、摘取茶树上的绿茶嫩芽，经过体积分数70%的乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将绿 茶嫩芽切成2-5mm长的小段，接种于MS培养基，控制室温在25 ± I °C，暗培养7天，诱导出乳 白色、土黄色、浅绿色三种不同颜色的茶叶愈伤组织； B、 制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取50-80% MS培养基、 10-40% 植物凝胶、3. 8-7. 5% ΝΑΑ、3. 5-7. 2% 蔗糖、0. 01-0. 3% 吲哚乙酸、0. 01-0. 36%-苄氨基 腺嘌呤、0. 01-0. 1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-78°C，搅拌到完全溶 解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液，调节溶液的PH至6. 3-6. 7 ; C、 选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例， 装入含250mL高产γ -氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速 控制在120rpm，培养温度控制在25±1°C，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养 12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得 茶叶干细胞固体粉末； D、 按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压 均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理； E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微 米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0. 45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-KTC 冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒 精淋洗干净后真空干燥，得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物。
[0009] 本发明提供了一种高含量γ -氨基丁酸茶叶干细胞培养技术，可进行大规模培养 获取大量的原材料，采用氨基酸分析仪测定，γ -氨基丁酸茶叶提取物的含量可达茶叶干细 胞干重的7. 5-10. 5%，γ -氨基丁酸茶叶提取物得率可达6. 0-8. 5%，γ -氨基丁酸茶叶提取 物中γ-氨基丁酸的含量大于96%。本发明制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物可用于 制备食品、保健品、化妆品以及药品。
[0010] 本发明通过采用特定的高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液，用植物干细胞培养 的方法获取富含γ -氨基丁酸的茶叶干细胞，培养周期短，可进行大规范生产，所得茶叶干 细胞固体粉末中γ -氨基酸的含量高；γ -氨基丁酸茶叶提取物的含量可达茶叶干细胞干 重的7. 5-10. 5%，是栽培茶通过各种工艺处理后的50倍左右。γ-氨基丁酸茶叶提取物得 率可达6. 0-8. 5%，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量大于96%。
[0011] 本发明所得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物在化妆品中应用，具有保湿功效，下 面为测试结果。
[0012] 本测试使用德国CK公司的Corneometer测试，恒温恒湿房间条件为25°C，50%相 对湿度，志愿者100人，平均分为5个小组，每组20人，分别涂抹空白样品、0. 5%透.5%透明 质酸钠（山东福瑞达公司，平均分子量为130万）及添加0. 5%、1. 0%和3. 0%实施例3制备 高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的乳液。
[0013] 1)受试者需要使用指定的洁面乳清洗双手前臂内侧，清洁后在受试者双手前臂内 侧做好测量区域标记。正式测试前应该在恒温恒湿房间内静坐20min，前臂暴露。
[0014] 2)使用Corneometer对受试者左右手臂内侧指定区域进行测量和记录。
[0015] 3)先测量各测试区域的初始值，求平均值，然后将试样均匀涂布于测试区域内。
[0016] 4)用Corneometer分别在样品使用后2小时、4小时、6小时、8小时进行测量受试 区域和空白对照区域的皮肤水合状态值，求平均值。测试由同一个测量人员完成。
[0017] 皮肤水分含量随时间延长变化情况，实验结果见表1(表中数字为实测的皮肤水合 状态值）
标注：样品A为未添加任何提取物的相同乳剂基质的空白样品；样品B为添加0. 5%透 明质酸纳样品的相同乳液基质的样品；样品C为添加0. 5%实施例3制备提取物的相同乳 液基质的样品；样品D为添加1. 0%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的相同 乳液基质的样品；样品E为添加3.0%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的相 同乳液基质的样品； 从上表可以看出，涂抹添加0. 5%实施例3制备高含量γ -氨基丁酸茶叶提取物的样品 C在使用后2小时、4小时、6小时、8小时后皮肤水分含量均高于添加0. 5%透明质酸钠样品 的相同乳液基质的样品Β，说明本发明制备的茶干细胞的保湿性能优于透明质酸钠；样品 C、D、E在使用使用后2小时、4小时、6小时、8小时后皮肤水分含量的值随着茶叶干细胞粗 提物添加量的增加而升高，呈现量效关系。
[0018] 本发明制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物在化妆品中具有抗皱功效，以下为 测试结果。
[0019] 测试方法：招募志愿者60人（年龄30至65岁），每组20人，分别使用添加0. 5%、 1. 0%和3. 0%实施例3制备茶叶干细胞粗提物的相同基质的膏霜，每天使用两次，每次半脸 使用，连续使用28后采用德国CK ΜΡΑ580弹性测试仪和美国CANFIELD公司VISIA皮肤分 析测试仪测试皮肤弹性和皱纹深度的变化。每天早晚清洁面部后取适量以上膏霜均匀涂 抹在左脸部，右边脸部涂抹未添加茶叶干细胞粗提取物的膏霜。
[0020] 使用样品28后使用MPA580弹性测试仪和VISIA皮肤分析测试仪测试左右两侧脸 部皮肤弹性和皱纹深度的变化，进行对比分析，实验