一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 氧化应激是指细胞活性氧（reactive oxygen species，R0S)生成和防止ROS损 伤的抗氧化能力之间失去平衡的状态，倾向于氧化，自由基的产生超过了抗氧化剂的防御 能力，而导致的细胞损伤（Gupta-Elera Gaytri et al·，2012)。ROS与多种疾病有息息相 关，在动脉粥样硬化、糖尿病、冠心病、皮肤病、呼吸道疾病等疾病中，ROS都起着重要作用， 尤其是在癌症和心血管疾病等发病率日益增高的疾病中的作用，引起当今各国学者的广泛 关注。ROS的产生和代谢失衡可引起多种器官功能异常或组织病变，因此寻找有效的抗氧化 剂就显得十分重要。
[0003] 目前，由于合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯（BHT)、丁基羟基茵香醚（BHA)等多数 技术复杂，成本较高，且有较大的毒性甚至致癌作用，使人们对合成抗氧化剂产生疑虑和排 斥心理，临床应用有较大的局限性，而天然抗氧化剂安全、低毒，符合新世纪人们对健康的 需求，因此，从资源丰富的天然药物中寻找高效、低毒、价廉的抗氧化剂已成为该领域研宄 的一个重要方向，其抗氧化作用机制的研宄，对进一步天然抗氧化药物的研宄开发具有重 要意义。
[0004] 黑果枸杞沿/iAeflica? Murr.)藏药称为"旁玛"，为前科（Solanceae)、前 族（Solanceae Reihb)、枸杞亚族wettst)、枸杞属L.)多年生灌木，具 棘刺，浆果球形，成熟后为紫黑色，有很高的光合效率和较强抗逆性，是我国西北特有的抗 盐抗旱野生植物种，主要分布于青海、甘肃、新疆等地(郭本兆等，1987)。黑果枸杞果实味甜 多汁，含丰富的维生素、有机酸及糖类，民间常生食或榨汁做饮料。黑果枸杞果实也具有一 定的医疗保健功能，其味甘、性平、清心热，藏医用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等 病症，并且药效显著，被收载于《四部医典》、《晶珠本草》等藏医药经典著作中；《维吾尔药 志》记载，维吾尔族医生常用黑果枸杞果实及根皮治疗尿道结石、月经不调、癣疥、齿龈出血 等病症；民间用作滋补强壮、明目及降压药。
[0005] 近年研宄表明，黑果枸杞的成熟果实富含原花青素、花色苷等黄酮类和多酚类活 性成分，且被证明是其发挥耐缺氧、抗疲劳、抗氧化、抗衰老等药理作用的重要物质基础 (Zheng et al.，2007)。为了更有效地发挥黑果枸杞的药用保健功效，研宄人员以黑果枸 杞果实为材料对其活性成分进行了提取工艺研宄。张元德等（2010)对黑果枸杞花色苷色 素微波辅助提取参数进行了优化研宄，结果表明在提取溶剂75%乙醇、辐射功率70 W、提取 时间20 min、料液比1 :50、浸泡时间20 h的条件下，花色苷色素提取率为15. 32%，提取物 中总花色苷含量为936. 27 mg/100 g。马玉婷等（2011)以黑果枸杞发酵后的皮渣为材料， 采用酶解法，研宄了其花色苷的最佳提取工艺条件。结果表明，黑果枸杞酒渣中花色苷的最 佳提取条件为以pH= I. 0的蒸馏水为浸提剂，按料水比I :40 (g :mL)、果胶酶加酶量0. 8%， 在50°C下酶解提取60 min条件下，色价为7. 903,但并未测定产物花色苷含量。授权专利 CN 103340983 B "黑果枸杞原花青素产品及其制备方法"公开了一种以黑果枸杞果实为原 料，经酸性水溶液提取、聚苯乙烯一二乙烯苯大孔树脂层析纯化，制备治疗人体白细胞降低 的药用提取物。由于黑果枸杞果实味甜多汁，目前市场上多榨汁做为保健功效饮料销售。专 利CN 101912480 B "一种黑果枸杞原花青素提取物的制备方法"公开了一种以黑果枸杞果 汁或黑果枸杞浓缩液为原料，经非极性大孔吸附树脂分离、真空减压浓缩或纳滤膜浓缩，制 备黑果枸杞原花青素提取物的方法。授权专利CN 101982192 B"黑果枸杞原花青素产品及 其制备方法"公开了一种黑果枸杞鲜果榨汁，果汁经陶瓷膜除杂、大孔树脂分离、超滤膜纯 化，制备种原花青素提取物的方法。
[0006] 果实榨汁后产生的果渣一直是食品工业果汁生产中亟待解决的难题。由于缺少合 理高效的再利用技术，绝大多数果渣中的活性成分得不到有效利用，往往被当做废弃物处 理，造成了极大的资源浪费。日益增长的黑果枸杞加工产业也是如此，目前所有的制备加工 技术均以黑果枸杞果实或果汁为原料，还没有果渣高效综合再利用技术的报道。
[0007] 因此，为了合理高效利用黑果枸杞资源，亟需提供一种操作简单、提取率高、安全 的利用黑果枸杞果渣高效利用的方法，并明确其应用范围。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的黑果枸杞天然复合 抗氧化剂的制备方法。
[0009] 为解决上述问题，本发明所述的一种黑果枸杞天然复合抗氧化剂的制备方法，包 括以下步骤： ⑴将黑果枸杞果渣与复合酶溶液按I :6~7. 5的质量体积比混匀后，在温度为40~50°C 的条件下静置40~60 min，得到混合溶液； ⑵将所述混合溶液与体积浓度为95~100%的乙醇混合，直至混合溶液中乙醇浓度达到 75%，然后在超声波-微波反应器中反应，得到黑果枸杞果渣提取物； ⑶将所述黑果枸杞果渣提取物与水按1 :1〇~15的质量体积比混匀后离心，得到上清 液，该上清液上弱极性大孔树脂色谱柱进行纯化，并依次用2~3倍柱体积的水和体积浓度 为70~90%的乙醇水溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液，该洗脱液经减压浓缩至原洗脱液体积 的30%后得到浓缩产物；所述浓缩产物于-70°C ~ -85°C预冻4~6 h后经冷冻干燥，即得到 黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂。
[0010] 所述步骤⑴中的黑果枸杞果渣是指茄科枸杞属多年生灌木植物黑果枸杞（ rwiAeflicw? Murr.)成熟果实榨汁后的固体废弃物。
[0011] 所述步骤⑴中的复合酶溶液是指将纤维素酶与果胶酶等质量混合后溶解于水中， 所得到的pH为4~5的溶液。
[0012] 所述步骤⑵中超声波-微波反应器的反应条件是指超声波功率为800~1000 W、微 波功率为300~330 W、反应时间为32~35 min、反应温度为60~70°C。
[0013] 所述步骤⑶中离心的条件是指转速为4000~5000 rpm，时间为15~20min。
[0014] 所述步骤⑶中减压浓缩的条件是指真空度0. 05~0. 08 MPa，温度50~70°C。
[0015] 所述步骤⑶中冷冻干燥的条件是指真空度为10~100 Pa、温度为-55°C ~ -70°C、 干燥时间为24~72 h。
[0016] 本发明与现有技术相比具有以下优点： 1、本发明利用黑果枸杞果汁生产中的副产物果渣，首先采用复合酶酶解技术破坏植物 细胞壁纤维素和果胶骨架，促进细胞内抗氧化活性成分的充分释放，随后同时利用低功率 微波穿透式内外加热和超声波空化作用，进一步提高活性成分的提取效率，并节省提取时 间；而且在提高提取效率的同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义。
[0017] 2、采用本发明得到的天然复合抗氧化剂最终产品为紫红色粉末，极易溶于水，经 测试其总抗氧化能力TEAC为182. 2~196· 3 mg TE/g，总酚含量为130. 78~145· 62 mg GAE/ g，总黄酮含量为 214·92~238·41 mg QE/g，总花色苷含量为 99·83~109·65 mg CGE/g。
[0018] ⑴总酚含量测定： 米用 Singleton and Rossi (1965)的 Folin-Ciocalteau 试剂比色法，在 96 孔板中 测定。具体操作：5 μ L待测样品溶液与60 μ L NaCO3 (7.5% w/v)溶液、15 μ L Folin-Ciocalteau试剂混合。然后，加入200 μ L水，60°C静置5 min。待反应液冷却至室温，700 rim波长下测定光吸收值。没食子酸（GAE)作为标准化合物，待测样品的总酚含量表示为每 克样品中没食子酸的毫克当量(mg GAE/g)。
[0019] ⑵总黄酮含量测定： 采用Chang et al. (2002)的比色法，在96孔板中测定。具体操作：5 yL待测样品溶 液加入到90yL甲醇中。随后，混合溶液中依次加入6 ULAlCl3(K) % w/v)溶液、6 yLl mol/L醋酸钾溶液和170 μ L水。静置反应30 min后，415 nm波长下测定光吸收值。懈皮 素（QE)作为标准化合物，待测样品的总黄酮含量表示为每克样品中槲皮素的毫克当量(mg QE/g)〇
[0020] ⑶总花色苷含量测定： 按照Nic〇u6 et al. (2007)所述的方法进行测定，具体操作：分别取1.5 mL待测样品 溶液，加入到10 mL容量瓶中，然后分别用0. lmol/L的磷酸缓冲液定容至10 mL。反应溶液 静置15 min后，分别于520 nm和700 nm波长下测定光吸收值。矢车菊素-3-0-葡萄糖 苷（CGE)作为标准化合物，待测样品的总花色苷含量按照下列公式计算，总花色苷含量表示 为每克样品中矢车菊素-3-0-葡萄糖苷的毫克当量(mg CGE/g)。
公式中，Jiiji为总的溶液吸收值，為2(hJ%pH=l、520 nm波长下光吸收值， 700 nm波长下光吸收值，#为矢车菊素-3-0-葡萄糖苷的摩尔质量（449.2 g/mol)，f 为矢车菊素-3-0-葡萄糖苷的摩尔吸光系数，/为光程（10 mm)。
[0022] ⑷分析结果参见表1。从表1可以看出，本发明所得的黑果枸杞果渣天然复合抗氧 化剂含有大量的酚类、黄酮类、花色苷类等活性化合物。
[0023] 表1黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂组成分析结果（n=3)
3、本发明所得的天然复合抗氧化剂经细胞氧化应激损伤保护能力检测显示，具有显著 的成纤维细胞UVB氧化损伤光毒性和心肌细胞阿霉素氧化损伤心脏毒性的防护作用，其细 胞氧化损伤保护能力显著优于阳性对照物一一葡萄籽提取物（GSE，多酚含量99. 04%)。
[0024] 实验采用"阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9c2心脏毒性氧化损伤细胞模型"和"UVB诱 导成纤维细胞HS68光毒性氧化损伤细胞模型"测定黑果枸杞果渣天然复合抗氧化剂的细胞 氧化应激损伤保护能力。葡萄籽提取物（GSE，多酚含量99. 04%，购自天津市尖峰天然产物 研宄开发有限公司）作为阳性对照物。
[0025] ⑴阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9c2心脏毒性氧化损伤保护能力评价： 目前，氧化应激被认为是心肌细胞凋亡或坏死的主要原因，特别是由抗肿瘤药物-阿 霉素（DOX)引起的心肌细胞氧化应激损伤是其心脏毒性的主要产生原因。因此，本实验采 用阿霉素诱导大鼠心肌细胞H9c2心脏毒性氧化损伤细胞模型来评价黑果枸杞果渣天然复 合抗氧化剂对于心脏毒性的保护作用。
[0026] 具体操作：大鼠心肌细胞H9c2采用DMEM培养基(含10%新生牛血清、2 mM谷氨酸 盐、1%链霉素/青霉素）培养，培养条件为温度37°C、5% CO2的无菌环境。培养基每2~3天 更换一次，细胞培养24h并达到80%聚集程度时，向培养基中加入黑果枸杞果渣天然复合 抗氧化剂，使其终浓度达到〇，10，20 or 40 μ g/mL培