Ch25h与25-ohc在免疫应答中的作用及其作为免疫调节剂在疫苗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种基因及其编码和代谢产物在调节免疫 应答中的作用，以及利用这种免疫调节作用在发展新型艾滋病药物和疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002] 胆固醇-25-轻化酶（cholesterol-25_hydroxylase，CH25H)及其催化形成的代谢 产物25-OHC(25羟基胆固醇）与脂代谢密切相关，例如25-OHC能抑制固醇的合成。近来的 研究表明CH25H属于干扰素刺激基因家族成员（ISG基因），研究表明CH25H及其代谢产物 25-OHC具有广谱抗病毒活性，然而其确切的抗病毒机制及其在调控免疫应答，尤其是调控 抗原特异性免疫应答方面还不清楚。
[0003] 人类获得性免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV)及其引起的艾 滋病（AIDS)已成为全球公共卫生的严峻挑战。截止2013年底，全球现存HIV感染者已增 至3500多万人，累记死亡病例超过3900万人。加强艾滋病的预防和控制已是刻不容缓的 问题。
[0004] 抗逆转录病毒治疗（antiretroviral therapy，ART)是当前控制HIV病毒感染和 传播的有效方式，但无法治愈HIV感染，而且也未明显改善HIV患者持续的炎症反应和免疫 活化状态，导致脂代谢异常、心血管疾病、神经性疾病等并发症的发生和发展。越来越多的 实验和临床数据表明炎症因子与HIV的免疫病理和AIDS进程的发展相关。其中，IL-I β 和IL-6被认为与CD4+ T细胞周转的频率和免疫功能的衰减有关，而且IL-I β信号可能是 肠潘纳斯细胞（Paneth cells)早期感知病毒感染并导致肠上皮损伤的重要因子；IL-17和 可溶性⑶14等直接或间接地参与了 AIDS相关疾病发生；TNF- α是导致HIV患者不能有效 控制病毒载量的另一重要炎症性因子等。因此，亟需寻找和开发能够同时调节机体代谢和 免疫应答的药物来控制机体的全身性炎症反应和免疫活化状态，这样更有益于减缓甚至治 愈HIV患者的疾病进程。
[0005] 此外，HIV疫苗仍然被认为是控制HIV传播的最有效手段，但仍未有HIV疫苗研发 成功。诱导产生具有保护效应的CD8+ T细胞免疫反应和HIV广谱中和抗体是当今HIV疫苗 设计的一个重要方向，而且⑶8+ T淋巴细胞和抗体的产生均与⑶4+ T淋巴细胞密切相关。 然而，HIV病毒的一个重要生物学特征是嗜⑶4+ T淋巴细胞，尤其是效应性的记忆⑶4+ T 淋巴细胞。这就提示我们艾滋病疫苗的难度非同寻常，因为接种了利用当今免疫学理论设 计出的常规疫苗后一般均会同时诱导产生⑶4+ T和⑶+ 8 T淋巴细胞免疫应答。事实上， 近期两项HIV疫苗临床试验（STEP和HVTN-503)遭到失败，其原因还待深入探讨，但数据表 明这些疫苗产生的能高度增殖的HIV/SIV Gag/Tat特异性CD4+ T细胞可能与该疫苗的失 败有相关性。因此，在T细胞靶向的HIV疫苗研究中，精确调控疫苗诱导产生的CD4+ T细 胞免疫反应和保护性CD8+ T细胞免疫反应将非常重要。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述存在的问题，本发明通过研究发现CH25H及其代谢产物25-OHC能有 效调节机体的免疫应答，表现为显著抑制炎症反应，降低非特异的细胞增殖和激活，降低艾 滋病毒特异性⑶4+ T淋巴细胞免疫应答。本发明进一步CH25H及其代谢产物25-OHC的 这种免疫调节作用可作为新型艾滋病疫苗的免疫调节剂，研究表明这种新型艾滋病疫苗产 生了理想的免疫应答效果。本发明将有利于开发新型有效的T细胞靶向的艾滋病药物和疫 苗。
[0007] 本发明的目的在于提供25-OHC在调节免疫应答中的应用。
[0008] 本发明的另一目的在于提供25-OHC作为免疫调节剂在发展新型疫苗中的应用。
[0009] 本发明所采取的技术方案是： 一种免疫调节剂，该免疫调节剂为胆固醇-25-羟化酶的编码基因、胆固醇-25-羟化 酶、25-羟基胆固醇中的至少一种。
[0010] 进一步的，上述免疫调节剂作为疫苗的免疫调节剂的应用。
[0011] 进一步的，上述疫苗为艾滋病疫苗。
[0012] 进一步的，上述艾滋病疫苗中抗原的基因选自gag、env、pol、nef、vif、tat、vpr、 vpx、rev中至少一种。
[0013] 进一步的，上述疫苗的形式为重组蛋白疫苗、重组质粒DNA疫苗或重组病毒载体 疫苗。
[0014] 上述免疫调节剂在制备防治炎症药物中的应用。
[0015] 进一步的，上述炎症为脂多糖引起的炎症。
[0016] 进一步的，上述炎症为病毒引起的炎症。
[0017] 进一步的，上述病毒为HIV。
[0018] 进一步的，上述炎症为炎症应答、非特异细胞增殖中的至少一种。
[0019] 本发明的有益效果是： 1)本发明发现了 25-OHC能显著抑制炎症免疫反应，其可抑制免疫细胞过高表达的 IL-Ib和TNF-a，对病毒(如HIV)感染患者持续性免疫活化和炎症反应的调节有很重要的应 用价值。
[0020] 2)本发明发现了 25-OHC能在不影响抗原特异性T淋巴细胞增殖的情况下，强烈抑 制有丝分裂原刺激的淋巴细胞过度增殖效应，这对减少HIV病毒感染导致细胞增殖活化以 及减少HIV感染的靶标细胞有重要意义。
[0021] 3)本发明发现了 25-OHC能调节机体的抗原性特异免疫应答，例如可抑制CD4+ T 淋巴细胞分泌IL-2和TNF-a的能力，但却不影响CD8+ T细胞的免疫应答和体液免疫应答。 这对减少HIV病毒感染的靶标细胞有重要意义。
[0022] 4)将25-OHC作为HIV疫苗的免疫调节剂，提高疫苗的免疫效果，可普遍用于预防 和治疗艾滋病。以上所述的免疫调节作用有助于新一代HIV疫苗的设计，即在不影响机体 保护性CD8+T细胞免疫功能的情况下，尽量降低CD4+ T细胞免疫应答。这些实验数据为新 型HIV疫苗策略进入临床前和临床试验奠定了基础。
[0023] 5)本发明所述的抗炎症反应和弱化⑶4+ T淋巴细胞免疫反应的方法同样适用于 其它相关自身免疫性疾病的防治。
【附图说明】
[0024] 图1为一定浓度的25-OHC对体外培养的淋巴细胞无明显毒性作用；（A)原代淋 巴细胞或淋巴细胞系用不同浓度25-OHC处理24 h后的细胞存活率；（B)原代淋巴细胞 用不同浓度25-OHC处理120 h后的细胞存活率；通过CCK-8 kit进行检测并计算得到 细胞存活率； 图2为25-OHC抑制LPS诱导的炎症反应；猕猴PBMC与不同浓度25-OHC和LPS共孵 育后，qRT -PCR定量检测炎症细胞因子的表达量变化，包括（A)/Z7戌（B) TM^(C) (D) CCL4-, 图3为25-OHC显著抑制有丝分裂原刺激的淋巴细胞非特异性增殖；CFSE染色的淋巴 细胞用25-OHC和非特异性刺激物共孵育4天后，通过多色流式技术分析淋巴细胞亚群的增 殖情况，A为淋巴细胞亚群增殖流式结果分析策略，B为25-OHC对ConA刺激的小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖的影响；C为25-OHC对有丝分裂原PMA+Ionomycin或ConA刺激的猕猴PBMC 中T淋巴细胞亚群增殖的影响；D为25-OHC对用R848+IL-2刺激的小鼠脾脏B淋巴细胞增 殖的影响，图示所述的"stimulator"为R848和IL-2 ; 图4为免疫期间连续尾静脉注射25-OHC不对小鼠主要生理指标产生明显的影响；（A) 小鼠免疫策略；B为小鼠实验期间的体重变化记录；C和D分别为小鼠全血白细胞（WBC)绝 对数目和淋巴细胞（LYM)比例；E和H分别为小鼠嗜中性粒细胞（NEU)、单核细胞（MONO)，嗜 酸性粒细胞（EOS)和嗜碱性粒细胞（BASO)占全血比重检测；图中Gl组为Ad5-Empty(不携带 目的基因的腺病毒免疫原)+乙醇（Eth);G2组为Ad5-SIVenv(携带SIV Env基因的腺病毒免 疫原)+乙醇；G3 组为 Ad5-SIVenv+l yg/20 g 体重的 25-OHC;G4 组为 Ad5-SIVenv+4yg/20 g体重的25-OHC ; 图5为低剂量的25-OHC促进体内IFN- γ ELISP0T细胞免疫应答；A和B分别为小鼠 初免3周和加强免疫2周后脾脏抗原特异性总IFN- γ的应答能力； 图6为25-OHC显著抑制体内抗原特异性CD4+ T淋巴细胞分泌细胞因子的能力；小鼠初 免3周后，多色流式技术分析小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子的能力；（A)单独分泌IFN- γ， TNF- α或者IL-2的⑶4+ T淋巴细胞比例；（B)双功能⑶4+ T淋巴细胞分泌IL-2/TNF- α或 IL-2/IFN- γ的能力；（C)分泌IFN- γ，TNF- α或者IL-2的CD8+ T淋巴细胞比例；（D)双 功能CD8+ T淋巴细胞分泌E-2/TNF- α的能力；图中Gl组为Ad5-Empty (不携带目的基因 的腺病毒免疫原）+乙醇（Eth);G2组为Ad5-SIVenV(携带SIVEnV基因的腺病毒免疫原）+ 乙醇；G3 组为 Ad5-SIVenv+l μ g/20 g 体重的 25-OHC ;G4 组为 Ad5-SIVenv+4 μ g/20 g 体 重的 25-OHC ; 图7为适量的25-OHC不影响脾脏或骨髓中IgG抗体分泌B淋巴细胞的形成；A和C分 别为ELISP0T检测SIV gpl40特异性的抗体分泌的浆细胞和记忆B淋巴细胞的数目；B和 D分别为ELISP0T检测总的的浆细胞和记忆B淋巴细胞的数目；E为小鼠血清中SIV env抗 原特异性结合抗体滴度； 图8为构建表达Ch25h基因的重组腺病毒（Ad5-Ch25h)的过程；A为Ad5-Ch25h构建 示意图；B、C、D均为构建Ad5-Ch25h重组腺病毒载体的电泳鉴定图。
【具体实施方式】
[0025] -种免疫调节剂，该免疫调节剂为胆固醇-25-羟化酶的编码基因、胆固醇-25-羟 化酶、25-羟基胆固醇中的至少一种。
[0026] 优选的，上述免疫调节剂作为疫苗的免疫调节剂的应用