生产免疫偶联物的方法
【专利说明】生产免疫偶联物的方法 发明背景 发明领域
[0001] 本发明提供制备活性免疫偶联物、包括抗CD22免疫偶联物的方法。合适地，该方 法包括分批进料过程和/或柱洗脱过程，相比未利用该方法的其他过程这些过程使得免疫 偶联物产率增加。
【背景技术】
[0002] 大规模、经济的蛋白质纯化是生物制药行业生产中的一个重要因素。治疗性蛋白 质典型地是使用原核或真核细胞系产生的，这些细胞系经过工程化处理以表达来自一种重 组质粒的感兴趣的蛋白质，该质粒包含编码该蛋白质的基因。将所希望的蛋白质从被送至 细胞的组分和细胞副产物的混合物中以足够纯度（例如足以用作一种人类治疗物的纯度） 进行分离由于多个原因对生物制品制造商提出了严峻的挑战。
[0003] 基于蛋白质的药物产物的制造商必须遵守严格的监管标准，包括极为严格的纯度 要求。为了确保安全性，监管机构（如美国食品与药品监督管理局（FDA))要求基于蛋白质 的药物产品基本上不含杂质，包括与产物相关的污染物（如聚集体）、该重组蛋白的片段和 变体以及与过程相关的污染物（如宿主细胞蛋白、培养基组分、病毒、DNA以及外毒素）。尽 管在生物制药行业可以获得并广泛使用不同的蛋白质纯化方案，但他们典型地包括一个亲 和纯化步骤，例如对于抗体而言进行蛋白A纯化，以便达到药学可接受的纯度。
[0004] 开发一个可适用于特定生物分子和不同生物分子两者的纯化方案（该方案是成 规模的、可控的，并且提供了高产率的纯化生物分子）将允许在整个药物开发过程的非常 早期的阶段将其整合至产品开发过程中。因此，令人希望的并且有利的是提供简单且有效 的过程，该过程能产生具有高质量和高安全性的药物物质。 发明概述
[0005] 在一个实施例中，提供制备活性免疫偶联物的方法。合适地，该免疫偶联物在一个 或多个残基处脱酰胺化，并且该脱酰胺化作用导致该免疫偶联物效力的抑制。合适地，该方 法包括在分批进料过程中再折叠该免疫偶联物并且在一个或多个色谱柱上纯化该再折叠 的免疫偶联物。
[0006] 在制备活性免疫偶联物的其他实施例中，其中所述免疫偶联物在一个或多个残基 处脱酰胺化，并且其中所述脱酰胺化作用导致所述免疫偶联物效力的抑制，该方法包括再 折叠所述免疫偶联物并且使用双循环洗脱在离子交换柱上纯化该再折叠的免疫偶联物，其 中在第一次洗脱和第二次洗脱之间利用剥离缓冲液剥离该柱，该剥离缓冲液包含乙醇胺、 精氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA)、尿素以及二硫苏糖醇（DTT)。
[0007] 在该方法的实施例中，再折叠该免疫偶联物包括具有9. 5或更小的pH的再折叠缓 冲液。
[0008] 合适地，该免疫偶联物包含抗体或其抗原结合片段，例如抗体或抗原结合片段包 括Fab、Fab'、F(ab'）2、Fd、单链Fv或scFv、双硫化物连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、 内抗体（intrabody)、IgGACH2、迷你抗体、F(ab'）3、四体抗体（tetrabody)、三体抗体 (triabody)、双体抗体（diabody)、单一结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、（scFv) 2、或 scFv-Fc。
[0009] 在示例性中，该抗体或抗原结合片段结合细胞表面受体，合适地是CD22。
[0010] 合适地，免疫偶联物包含毒素，例如毒素包括但不限于绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒 素、相思豆毒素、白喉毒素及其亚单位，连同肉毒杆菌毒素 A至F和变体、以及它们的衍生 物。
[0011] 在示例性实施例中，该毒素是绿脓杆菌外毒素或其变体，它合适地具有选自下组 的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO: 16至22。
[0012] 在实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含VH和VL序列，合适地该VH序列选自 下组，该组由以下各项组成：SEQ ID N0:6至11，并且该VL序列选自下组，该组由以下各项 组成：SEQ ID NO:2以及12至15。
[0013] 在示例性实施例中，该免疫偶联物包含抗CD22抗体或其抗原结合片段以及PE或 其变体，合适地该免疫偶联物是Moxetumomab pasudotox免疫毒素，该免疫毒素包含SEQ ID NO: 1的VH-PE38亚单位以及SEQ ID NO: 2的VL亚单位。
[0014] 在实施例中，该再折叠缓冲液具有9. 4的pH。
[0015] 在合适的实施例中，该分批进料过程使用约52mL溶解的包涵体每L再折叠缓冲液 每小时至约13mL溶解的包涵体每L再折叠缓冲液每小时的添加速率，更合适地约35mL溶 解的包涵体每L再折叠缓冲液每小时至约17mL溶解的包涵体每L再折叠缓冲液每小时的 添加速率，或约30mL溶解的包涵体每L再折叠缓冲液每小时至约18mL溶解的包涵体每L 再折叠缓冲液每小时的添加速率，或约26mL溶解的包涵体每L再折叠缓冲液每小时的添加 速率。
[0016] 合适地，在各种方法中使用的剥离缓冲液包含约30至60mM乙醇胺、约0. 25至约 0. 75M精氨酸、1至3mM EDTA、约7至9M尿素以及约9至IlmM DTT。
[0017] 还提供包含具有小于约25%与约1 %之间的脱酰胺化种类的免疫偶联物的组合 物，其中该免疫偶联物通过在此披露的各种方法制备。
[0018] 在此还提供制备活性免疫偶联物的方法，其中该免疫偶联物在一个或多个残基处 脱酰胺化，并且其中该脱酰胺化作用导致所述免疫偶联物效力的抑制。合适地，该方法包 括在分批进料过程中在具有9. 5或更小的pH的再折叠缓冲液中再折叠该免疫偶联物，并 且使用双循环洗脱在离子交换柱上纯化该再折叠的免疫偶联物，其中在第一次洗脱和第二 次洗脱之间利用剥离缓冲液剥离该柱，该剥离缓冲液包含乙醇胺、精氨酸、乙二胺四乙酸 (EDTA)、尿素以及二硫苏糖醇（DTT)。
[0019] 合适地，从该制备方法回收的免疫偶联物的量比利用不包括分批进料再折叠过程 和/或在已使用剥离缓冲液剥离的离子交换柱上的双循环洗脱的方法回收的免疫偶联物 的量大至少三百％ (300% )。
[0020] 参照附图，下文详细地描述了这些实施例的另外的实施例、特征、和优点，连同不 同实施例的结构和操作。 附图简要说明
[0021] 图1示出如在此所述的用于Moxetumomab pasudotox的合适复性和纯化工序流 程。
[0022] 图2示出Fractogel TMAE(M)捕获步骤（循环1)的结果。
[0023] 图3示出羟磷灰石色谱的结果。
[0024] 图4示出苯基650M色谱的结果。
[0025] 图5示出Q琼脂糖HP色谱的结果。柱上样量是10. 4g/L。
[0026] 图6示出部分纯化的Moxetumomab pasudotox的IEC分析的结果。
[0027] 图7示出Fractogel TMAE(M)捕获步骤（循环1)的结果。
[0028] 图8示出羟磷灰石色谱的结果。
[0029] 图9示出苯基650M色谱的结果。
[0030] 图10示出Q琼脂糖HP色谱的结果。
[0031] 图11示出Fractogel TMAE(M)捕获步骤色谱的结果。
[0032] 图12示出Fractogel TMAE(M)残留色谱的结果。
[0033] 图13示出使用Moxetumomab pasudotox包涵体（IB)溶解缓冲液用于柱清洁的 Fractogel TMAE(M)色谱的结果。
[0034] 图14示出利用IB溶解缓冲液的Fractogel TMAE(M)残留色谱的结果。
[0035] 图15示出利用IB溶解缓冲液的Fractogel TMAE(M)空白缓冲液色谱的结果。
[0036] 图16示出9次纯化循环之后的Fractogel TMAE(M)残留色谱的结果。
[0037] 图17示出代表性卡普托蓝（Capto Blue)琼脂糖色谱的结果。
[0038] 图18示出图17所示卡普托蓝琼脂糖纯化级分的非还原的SDS-PAGE分析的结果。
[0039] 图19示出代表性卡普托蓝琼脂糖捕获步骤色谱的结果。 发明详细说明
[0040] 应该领会的是在此展示和描述的这些具体的实现方式是实例，并且不旨在以任何 方式在其他方面限制本申请的范围。
[0041] 在此提及的这些公开的专利、专利申请、网站、公司名称、以及科学文献特此以其 全文形式通过引用而结合，达到如同每个被确切并单独地表明而通过引用结合的相同程 度。在此引用的任何参考文件与本说明书的具体传授之间的任何冲突应以有利于后者的方 式来解决。同样，在单词或短语的领域理解的定义与如在本说明书中确切传授的该单词或 短语的定义之间的任何冲突应以有利于后者的方式来解决。
[0042] 如在本说明书中所使用，单数形式"一个/种（a，an)"以及"该"具体地还涵盖 它们所提及的术语的复数形式，除非本内容清楚地另外指明。在此使用术语"约"以意指 大约（approximately)、在......的附近（in the region of)、粗略地（roughly)、或左右 (around)。当术语"约"与一个数值范围结合使用时，它通过扩展列举的数值的上限和下限 将该范围加以修饰。通常，在此使用术语"约"以将一个数值以高于和低于该规定值的20% 的变化加以修饰。
[0043] 在此使用的技术术语和科学术语具有由本申请涉及的领域的普通技术人员通 常理解的含义，除非另外定义。在此参考了本领域的普通技术人员已知的不同方法和材 料。陈述重组DNA技术的一般原理的标准参考作品包括萨姆布鲁克等人，"分子克隆： 实验指南"，第2版，冷泉港实验室，纽约（1989) ("Molecular Cloning:A Laboratory Manual, " 2nd Ed. ,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989));考夫 曼等人编，"医学生物学分子和细胞方法手册"，CRC出版社，博卡拉顿（1995) (Kaufman et al., Eds. , "Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology in Medicine，"CRC Press，Boca Raton(1995));以及麦克弗森编，"定向诱变：实用方 法"，IRL 出版社，牛津（1991) (McPherson, Ed.，"Directed Mutagenesis:A Practical Approach, " IRL Press, 0xford(1991))，这些作品各自的披露内容以其全文通过引用结合 在此。
[0044] 术语"多肽"、"肽"、"蛋白质"以及"蛋白质片段"在此可以互换使用以便表示氨基 酸残基的聚合物。这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是一种对应 的自然产生的氨基酸的人工化学模拟物，并且适用于自然发生的氨基酸聚合物以及非自然 发生的氨基酸聚合物。
[0045] 术语"氨基酸"是指自然发生的以及合成的氨基酸，连同与自然发生的氨基酸功能 类似的氨基酸类似物以及氨基酸模拟物。自然发生的氨基酸是通过遗传密码编码的那些氨 基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ -羧基谷氨酸盐、以及〇-磷酸丝氨 酸。氨基酸类似物是指以下化合物，这些化合物具有与自然发生的氨基酸相同的基本化学 结构，例如与氢相结合的碳、羰基基团、氨基基团、以及R基团，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲 硫氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。这些类似物能具有经修饰的R基团（例如正亮氨酸）或经修 饰的肽骨架，但保留了与自然发生氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指以下化 学化合物，这些化合物具有不同于通常的氨基酸的化学结构的、但与自然发生的氨基酸的 功能相类似的结构。带负电的氨基酸包括天门冬氨酸（或天门冬氨酸盐）以及谷氨酸（或 谷氨酸盐）。带正电的氨基酸包括精氨酸、组氨酸以及赖氨酸。
[0046] 在此有待纯化的"组合物"包括感兴趣的多肽以及一种或多种杂质。该组合物可 以被"部分纯化"（即已经经受一个或多个纯化步骤，或可以直接从产生该多肽的宿主细胞 或生物体中直接获得（例如，该组合物可以包括收获的细胞培养液）。
[0047] "酸性变体"是多肽或免疫偶联物的变体，它比该感兴趣的多肽更具有酸性（例如， 通过阳离子交换色谱确定的）。酸性变体的实例是脱酰胺化的变体。脱酰胺化的蛋白质是 以下蛋白质，它们的某些或全部游离酰胺功能基团被羟基化成为羧酸，例如将谷氨酰胺转 化成谷氨酸。这一反应的速率取决于一级序列、三维结构、ΡΗ、温度、缓冲液类型、离子强度 以及其他溶液特性。重要的是，脱酰胺化反应将负电荷导入该分子。如以下进一步说明，这 种蛋白质脱酰胺化反应对蛋白质活性可具有一种负影响。
[0048] 如在此所使用，术语"抗体"和"免疫偶联物"在最广泛的意义上可以互换使用，并 且包括单克隆抗体（例如，全长或完整的单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗 体（例如，双特异性抗体，只要它们展示出所希望的生物活性）以及在此说明的抗体片段。 术语"双特异性抗体"旨在包括以下任一抗体，它具有两种不同的结合特异性，即该抗体结 合了两种不同的表位，这些表位可位于相同的靶抗原或更常见地位于不同的靶抗原上。
[0049] 天然抗体和免疫偶联物通常是约150, 000道尔顿的异四聚体糖蛋白质，由两个 相同的轻（L)链和两个相同的重（H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链 相连，而二硫键的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有 规律性间隔的链间二硫桥。每条重链在一端具有一个可变结构域（VH)，之后跟随多个恒 定结构域。每条轻链在一端具有一个可变结构域（VL)并且在另一端具有一个恒定结构 域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链的可变结构域与重链的 可变结构域对准。具体氨基酸残基被认为形成轻链可变结构域与重链可变结构域之间的 一个连接（克劳斯尔等人，生物分子学杂志，186, 651-66, 1985 (Clothia et al.，J. Mol. Biol. 186,651-66, 1985));诺沃特和哈伯，美国科学院院刊，82, 4592-4596 (1985) (Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4592-4596 (1985)))。基于重链的组成，定义了五 类人类免疫球蛋白，并且被命名为IgG、IgM、IgA、IgE、以及IgD。IgG类抗体与IgA类抗体被 进一步分成以下亚类：即，IgGl、IgG2、IgG3及IgG4、以及IgAl和IgA2。IgG、IgA以及IgD 抗体中的重链具有三个恒定区结构域，它们被指定为CHI、CH2以及CH3,并且IgM和IgE抗 体中的重链具有四个恒定区结构域CHI、CH2、CH3以及CH4。因此，重链具有一个可变区以 及三个或四个恒定区。免疫球蛋白结构和功能评述于例如哈洛（Harlow)等人编，抗体技术 实验指南（Antibodies:A Laboratory Manual)，第14章，冷泉港实验室，冷泉港（1988)中。
[0050] 术语"抗体片段"是指完整抗体的一部分，并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗 体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab'）2、Fv以及单链Fv片段、线性抗体、单链抗 体、以及从抗体片段形成的多特异性抗体。
[0051] 在此所使用的术语"单克隆抗体"是指从基本上均质抗体的群体中获得的抗体，即 单个抗体，这些抗体包括除了可能自然发生的突变（可能少量存在）之外其他均相同的群 体。单克隆抗体是高特异性的并且结合单一抗原。而且，与典型地包括指向不同决定簇（表 位）的不同抗体的多克隆制剂相比，每种单克隆抗体指向该抗原上的单一决定簇。抗体"选 择性地结合"或"特异性地结合"是指与可替代的物质（包括不相关的蛋白质）相比，该抗 体与一个位点反应地或联系地更加频繁、更加快速、持续时间更长、亲和力更大、或以上特 点的组合。"选择性地结合"或"特异性地结合"是指抗体与蛋白质以至少约0.1 mM，但更通 常至少约1 μM的Kd结合。"选择性地结合"或"特异性地结合"有时是指抗体与蛋白质有 时以至少约0. 1 μ M或更好的Kd结合，并且在其他时候以至少约0. 01 μ M或更好的K D结合。 由于不同物种的同源蛋白之间的序列一致性，特异性结合可包括识别多于一种物种的肿瘤 细胞标记蛋白的抗体。
[0052] 在此的抗体特定地包括"嵌合"抗体，在这些抗体中重链和/或轻链的一部分与来 源于特定物种或属于特定抗体类型或亚类的抗体中对应的序列一致或同源，而这些链的其 余部分与来源于另一物种或属于另一个抗体类型或亚类的抗体、以及这些抗体的片段中对 应的序列一致或同源，只要它们展示出令人希望的生物活性（美国专利号4, 816, 567 ;以及 莫里森等人，美国国家科学院院刊，57:6851-6855 (1984))。
[0053] 非人类（例如，鼠类）抗体的"人源化"形式是包含来源于非人类免疫球蛋 白的最小序列的嵌合抗体。通常，人源化抗体是人类免疫球蛋白（受体抗体），其中 来自该受体的高可变区的残基被来自非人类物种（供体抗体）（如具有所希望的特 异性、亲和力以及能力的小鼠、大鼠、兔或非人类的灵长类动物）的高可变区的残基 代替。在一些情况下，人类免疫球蛋白的构架区（FR)残基被对应的非人类残基代 替。而且，人源化抗体可以包括在该受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些 修饰以便使抗体性能进一步改进。通常，该人源化抗体将基本上都包括至少一个、并 且典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高可变环对应于一种非人类免疫 球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是具有人类免疫球蛋白序列的FR。该人 源化抗体可任选地还应当至少包括免疫球蛋白恒定区（Fe)的一部分，典型地人类免 疫球蛋白的一部分。更多细节参见琼斯等人，自然，327:522-525(1986) (Jones et al·，Nature 327:522-525(1986));雷切曼（Riechmann)等人，自然，332:323-329 (1988) (Riechmann et al. ,Nature 332:323-329(1988));以及普雷斯塔，现代结构生物学评 论，2:593-596(1992) (Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992))。还请见以下综 述文章及其中所引述的参考文献：瓦斯瓦尼和汉密尔顿，变态反应、哮喘和免疫学年报， 7:105-1 15(1998) (Allergy，Asthma&Immunol.7:105-l 15(1998