治疗乙型肝炎的组合物和方法

治疗乙型肝炎的组合物和方法
【专利说明】治疗乙型肝炎的组合物和方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年9月26日提交的美国临时申请号61/706, 083的优先权，其 全部内容通过引用并入本申请。
[0003] 关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明在美国国立卫生研究院提供的基金号为GM059083、GM079097和GM088241 的政府支持下进行。政府享有本发明的一些权益。 发明领域
[0005] 本发明涉及治疗乙型肝炎病毒（HBV)感染的组合物和方法。特别地，本发明涉及 通过调节HBV X蛋白与Bcl-2家族蛋白之间的相互作用或通过降低Bcl-2家族蛋白的表达 水平治疗乙型肝炎感染的组合物和方法。
[0006] 发明背景
[0007] 世界上有超过4亿人受乙型肝炎病毒（HBV)感染并且其是肝细胞癌（HCC)和其他 肝脏疾病的主要起因。其已在多个国家中成为主要的健康问题。尽管目前HBV疫苗能够阻 止新型HBV感染，但是对于慢性HBV携带者仍没有有效的治疗方法，其中有很多人将最终发 展成多种肝脏病症和HCC。
[0008] 研究已显示HBV编码的关键致病和致癌蛋白之一是17-kDa HBV X蛋白（HBx)13HBx 是一种多功能HBV蛋白，已发现其对HBV感染和发病机制具有关键作用并且能够导致肝细 胞癌。如其名称所恰如其分体现的，HBx是一种能够与多种体外系统中数量巨大的多种蛋 白结合的神秘莫测的蛋白。不幸的是，对HBx确切的宿主靶点和作用机制还知之甚少。事 实上，到目前为止鉴定HBx的细胞靶点及其作用机制仍是一个重大的挑战。由于HBx在HBV 感染和发病机制中具有作用，据信对特异性的HBx细胞靶点的鉴定将为慢性HBV携带者的 治疗提供重要的治疗潜能。
[0009] 因此，存在对于鉴定HBx的细胞靶点或配体的需求。此外，存在对于通过靶向HBx 的细胞靶点治疗HBV感染的需求。
[0010] 发明概述
[0011] 本发明的一些方面基于本发明人的发现：人抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL是HBx的 宿主靶点。此外，本发明人发现了 HBx与Bcl-2、Bcl-XL或后两者之间的相互作用是刺激胞 质钙升高、HBV病毒复制和诱导细胞死亡所需的。本发明人关于Bcl-2蛋白作为HBx诱导 的病毒复制和宿主细胞死亡的宿主靶点的这些发现对于鉴定和/或生产用于治疗慢性HBV 患者的组合物是有用的。
[0012] 研究已发现HBV病毒DNA滴度高的患者更可能发展成HCC。因此，在本发明的一 些实施方式中，本发明人的发现能够用于显著降低HBV的复制，从而减小发展成HCC的可能 性。事实上，本发明人在本申请中公开的发现能够通过例如显著减少HBV的复制用于治疗 与HBV感染相关的多种临床状况。能够由本发明的组合物和方法治疗的示例性的临床状况 包括但不限于由HBV活化的坏死和凋亡诱导的宿主炎症、肝硬化、HCC和肝炎。
[0013] 在一些实施方式中，本发明的组合物与HBx的Bcl-2同源性3 (BH3)样基序（即， BH3结构域）、Bcl-2或Bcl-xL或者其他Bcl-2家族成员结合。
[0014] 附图简述
[0015] 图Ia显示了 peptaibol TK序列比对。红色框中突出显示的是序列之间的微小差 异。
[0016] 图Ib是显示p印taibol TK在ced_l(el735)胚胎中导致更加持续的细胞尸体 (cell corpse)产生的柱状图。所检查的胚胎阶段为逗号期、1.5倍、2倍、2. 5倍、3倍和4 倍。y轴表示记录的细胞尸体平均数和误差线表示SEM。
[0017] 图Ic是显示peptaibol TK在ced-1 (el735)动物的种系中导致更加持续的细胞尸 体的柱状图。记录L4进入成虫蜕皮后24小时和48小时动物中生殖细胞的尸体（η = 30)。
[0018] 图Id是显示对秀丽线虫（C. elegans)核心凋亡通路中peptaibol TK革巴点进行 化学遗传分析的柱状图。对下述细胞死亡突变体进行Peptaibol TK处理：ced-1 (el735)、 ced-1 (el735) ;egl-l(n3082)、ced-1 (el735) ;ced-9(nl950gf)、ced-1 (el735); ced-4(nll62)、ced_l(el735) ;ced_3(n2433)和 ced-l(el735)smIslll;ced_4(nll62)〇 smlslll是携带Pegl iacCED-3的整合的转基因。在各次实验中记录2倍阶段的胚胎。
[0019] 图Ie是显示p印taibol TK能够与EGL-I协同作用而诱导凋亡的柱状图。使用 peptaibol TK处理ced-1 (el735) ;egl_l(n3082) ;smls82动物并对其进行热休克处理。记 录2倍阶段胚胎的细胞尸体。smls82是携带PhspEGL-I的整合的转基因。数据为平均值 土SEM。在各次实验中记录超过20个的胚胎（b，d，e)或超过30只动物（c)。#P〈0. 01 ; #*P〈0. 001。
[0020] 图If是显示在秀丽线虫中p印taibol TK与核心凋亡通路相互作用的示意图。 Peptaibol TK可能在EGL-I上游或与之平行的诱导和增强凋亡。
[0021] 图2是显示在秀丽线虫中p印taibol TK增强HBx诱导的细胞死亡的图。使用5 μΜ peptaibol TK处理两种不同的HBx转基因动物smls98和bzls8 ;smEx (Pmec 7ΗΒχ)和缺乏HBx 表达的两种对照转基因动物smls3和bzls8。smls98是含有Pniee 3GFP和Pniee 7ΗΒχ的整合的 转基因。smls3是含有3GFP的整合的转基因，其在包括PLM触觉感受器神经元的10个 秀丽线虫感觉神经元中指导GFP表达。bzls8是含有P_ 4GFP的整合的转基因，其在包括 PLM神经元的6个秀丽线虫触觉感受器神经元中指导GFP表达。使用Nomarski显微镜记录 GFP阳性PLM神经元的存在情况。数据以三类表示：两个PLM均丢失（黑色柱）、一个PLM 丢失（灰色柱）和无 PLM丢失（白色柱）。y轴表示每一类的百分率。柱子下方的百分数 表示在各次实验中的总PLM缺失百分比。在各次实验中记录超过40只动物。
[0022] 发明详述
[0023] 乙型肝炎病毒（HBV)感染能够导致多种临床状况包括但不限于发展成肝炎 (hepatitis)、肝脏炎症（liver inflammation)、肝硬化和肝细胞癌（HCC)。HBV感染是在 世界范围内导致患病和死亡的主要原因 。HBV X蛋白（HBx)是HBV发病的重要效应器，但 其细胞靶点和作用机制到目前为止仍不明确。本申请披露了发明人的一个发现，在哺乳动 物的肝细胞中HBx与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL通过Bcl-2同源性3 (BH3)样基序相互作 用。本发明人还观察到阻止HBx与Bcl-2和Bcl-xL的结合的BH3-样基序中的突变消除了 肝细胞中由HBx的表达导致的胞质钙升高和细胞死亡并使HBV的复制严重受损。由HBx的 BH3样基序中的突变引起的HBV复制极大降低能够基本上被胞质钙的恢复所挽救。这些结 果表明HBx与Bcl-2家族成员结合并且随后使得胞质钙升高对于HBV病毒的复制而言是重 要的。
[0024] 而且，通过RNA干扰敲低Bcl-2或Bcl-xL导致在肝细胞中出现由HBx诱导的钙升 高减少和病毒复制减少。这些结果进一步表明HBx通过其BH3样基序靶向Bcl-2蛋白，其 促进了在HBV发病过程中的胞质钙升高、细胞死亡和病毒复制。因此，本发明的一些方面提 供了通过以下治疗HBV感染的方法：（i)抑制HBx与Bcl-2家族蛋白结合，（ii)减少Bcl-2 家族蛋白的表达或（iii)其组合。
[0025] HBV是肝细胞特异性DNA病毒，其编码若干不同的病毒蛋白，包括DNA聚合酶、表面 抗原、核心抗原和X蛋白（HBx)。尽管在HBV DNA复制和病毒粒子组装中其他病毒基因的 功能已被很好地揭示，但是HBx在HBV感染和发病中的作用及其机制仍不明确。HBx参与 介导HBV感染细胞中的多种病毒和细胞事件，包括病毒复制、转录因子的反式激活、信号转 导、细胞周期进展和细胞死亡。尽管在细胞质和细胞核中均发现了 HBx，但是线粒体似乎是 HBx作用的重要位点，因为已发现HBx的表达诱导线粒体聚集、线粒体膜电势丢失和细胞色 素 C的释放。
[0026] HBx对于HBV感染肝脏中的病毒致病和肿瘤形成是必需的。已发现HBx基因是HCC 中最常见的整合的病毒序列之一。事实上，在大多数HBV相关的HCC患者中，甚至是在不存 在病毒DNA复制的情况下，均检测到了 HBx蛋白。在一些情况下，在HCC组织中已鉴定出了 HBV变体携带HBx的突变。此类突变导致HBx依赖性活性的丧失，这表明进化中的HBx功能 可能是HBV相关的肝脏疾病的基础。在缺乏HBV病毒粒子的其他组分的转基因小鼠中还发 现了 HBx促进肝脏肿瘤发生。因此，HBx在HBV相关HCC的发展中具有重要作用是明确的。
[0027] 已发现钙信号传导对多种HBx活性具有重要作用。例如，已发现HBx诱导的胞质 钙升高对HBV DNA的复制、HBV核心组装以及若干转录事件和信号传导级联的活化具有重 要作用。HBx诱导凋亡和坏死也需要胞质钙增加和线粒体渗透性改变（MPT)，这是一个在内 稳态和细胞死亡过程中线粒体通过其调控细胞钙的过程。然而，到目前为止尚未鉴定与HBx 相互作用以诱导MPT和胞质钙增加的细胞靶点。
[0028] 已在多个体外系统中发现了多种与HBx相互作用的蛋白。然而，尚未在重演肝细 胞中HBV感染的条件下确证这些蛋白大部分的相互作用。复杂哺乳动物系统的遗传冗余性 是对HBx细胞靶点进行确定性鉴定的主要障碍。使用遗传上易控的秀丽线虫动物模型，本 发明人发现了 HBx直接与Bcl-2的同源物CED-9相互作用以诱导胞质钙升高和细胞死亡， 这模拟了肝细胞中HBx表达的下游的两个重要事件。此外，本发明人发现了 HBx与肝细胞 中的两个Bcl-2家族成员（Bcl-2和Bcl-xL)相互作用以诱导胞质钙升高、细胞死亡和病毒 DNA复制。
[0029] HBV X基因是HBV基因组的四种编码基因之一，其编码HBV感染和复制所必需的多 功能蛋白（HBx)。HBx还影响感染细胞中的多种细胞事件，包括转录、信号转导、蛋白酶体活 性、细胞周期进展和细胞死亡。HBx在HBV感染的患者中还显示出对肝细胞的肿瘤转化具有 重要作用。甚至在仅表达HBx的转基因小鼠中，也发现了肝脏肿瘤的高发生率，这表明HBx 和HCC之间具有因果关系。
[0030] 已通过研究在肝细胞中建立了 HBx的表达与坏死和凋亡的激活之间的联系。HBx 能够通过多种损伤使肝细胞对细胞死亡敏化，包括使用肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和剥夺 生长因子。HBx还显示出诱导线粒体聚集、线粒体膜电势丢失和细胞色素 C释放，这表明HBx 可能通过线粒体发挥诱导细胞死亡的作用。凋亡和坏死也是在HBx转基因小鼠中肝脏发病 的早期事件并且其能够导致肝硬化和HCC的发生。尽管这些结果均提示HBx具有肝毒性作 用，但是到目前为止HBx用于促进细胞死亡和HCC发展的细胞靶点和信号通路仍是不明确 的。不受任何理论的束缚，据信慢性肝细胞死亡导致以下循环：炎性细胞因子释放、局部肝 损伤和代偿性再生，导致持续获得致癌性突变并发展成HCC。因此，对介导HBx诱导细胞死 亡的细胞靶点和通路的鉴定能够导致对包括多种肝脏疾病在内的HBV相关临床状况的治 疗学有效治疗。
[0031] 已发现钙信号传导对多种多样的HBx活性均具有重要作用。例如，已发现HBx在 感染HBV的肝细胞中负责触发胞质Ca 2+增加，这是HBV DNA复制所需的。HBx诱导的胞质 Ca2+升高还对HBV核心组装、一些HBx活化的转录事件以及包括JNK和MAPK通路在内的一 些信号传导级联的活化具有重要作用。还显示HBx通过改变胞质Ca 2+调节细胞死亡。尽管 已发现在Ca2+调控中HBx靶向线粒体和线粒体渗透性转变（MPT)，但是与HBx相互作用以 改变胞质Ca 2+的细胞靶点在本发明人在本申请中披露其发现之前是未知的。
[0032] 考虑到在哺乳动物中进行HBx研究的复杂性，本发明使用了简单的、遗传上易控 的动物模型秀丽线虫鉴定HBx的靶点和信号通路。如本申请所公开的，本发明人披露了人 Bcl-2同源物CED-9是与HBx相互作用以诱导胞质Ca2+增加和细胞凋亡的细胞靶点。
[0033] 本发明一个特定的方面提供了在受试者中治疗乙型肝炎感染的方法。此类方法 包括对需要此类治疗的受试者施用组合物，所述组合物（i)能够在所述受试者中抑制乙型 肝炎病毒X蛋白与Bcl-2家族成员蛋白的结合；（ii)能够在所述受试者中减少Bcl-2家 族成员蛋白的表达；或（iii)其组合。应注意的是，术语对疾病的"治疗"（"treating"或 "treatment"）包括：（1)预防所述疾病，即使得在受试者中不出现所述疾病的临床症状，所 述受试者可能暴露于所述疾病或对所述疾病易感但是尚未经历或显示出所述疾病的症状； (2)抑制所述疾病，即阻止或减轻所述疾病或其临床症状的发展；或者（3)缓解所述疾病， 即使得所述疾病或其临床症状减轻。术语"抑制"蛋白指降低所述蛋白的水平或者其活性或 表达的程度。例如，抑制Bcl-2蛋白包括降低Bcl-2基因转录、Bcl-2基因翻译和/或Bcl-2 蛋白活性。可以采用本领域技术人员公知的任意方法容易地确定某种组合物对特定蛋白的 抑制情况，例如通过确定间接或直接受到所述基因编码蛋白表达影响的任意参数或通过确 定所述蛋白的活性。此类参数包括但不限于RNA或蛋白水平的改变、蛋白活性的改变、产物 水平的改变、下游基因表达的改变、报告基因转录的改变（荧光素酶、CAT、β -半乳糖苷酶、 β _葡糖醛酸糖苷酶、绿色焚光蛋白（参见例如Mistili&Spector, Nature Biotechnology 15:961-964(1997));信号转导、磷酸化和去磷酸化、受体-配体相互作用、第二信使浓度 (例如cGMP、cAMP、IP3和Ca2+)和细胞生长的改变。
[0034] 在一些实施方式中，Blc-2家族成员蛋白包括Bcl-2、Blc-xL、另一种Bcl-2成员或 其组合。
[0035] 在其他实施方式中，所述组合物包含结合抑制剂，所述结合抑制剂能够抑制乙型 肝炎病毒X蛋白与所述Bcl-2家族成员蛋白结合。此类结合抑制剂可以是有机小分子或药 物、小肽、小RNA分子如适体、抗体、siRNA(短抑制性RNA)或短发夹RNA(shRNA)，其减少相 应基因的表达，如在实施例章节中所公开的那些。此外，能够使用本申请所述的程序容易地 确定能够抑制Bcl-2家族成员蛋白表达的其他适宜的shRNA。此类适宜shRNA的合成是公 知的并且通常能够使用任意市售自动寡核苷酸合成仪实现。能够抑制Bcl-2家族成员蛋白 活性的有机小分子（例如分子量小于IkD的）也能够通过使用本申请所公开的测定技术容 易地确定。而且，能够抑制HBx与Bcl-2家族成员蛋白结合的有机小分子也能够通过使用本 申请所公开的方法以及使用计算机辅助模拟容易地鉴定。适宜有机小分子的合成是本领域 技术人员公知的。此类化合物可以制备为化学物质阵列并针对活性化合物进行筛选。在一 些实施方式中，使用能够抑制HBx与Bcl-2家族成员蛋白结合的抗体治疗HBV感染。在一 些例子中，本发明的组合物包括使用抗体，所述抗体能够靶向乙型肝炎病毒X蛋白的Bcl-2 同源性3 (BH3)样基序、Bcl-2家族成员蛋白或其组合。抑制HBx与Bcl-2家族成员蛋白结 合的适宜抗体是本领域技术人员在阅读了本申请后能够使用任意公知的抗体生产方法容 易地制备的。
[0036] 在其他实施方式中，所述结合抑制剂能够与乙型肝炎病毒X蛋白的Bcl-2同源性 3(BH3)样基序相互作用。如本申请所公开的