一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具的制作方法【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物体复杂组织器官的人工制造
技术领域：
，特别涉及一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具。【
背景技术：
】[0002]世界上每年患有组织缺损或器官衰竭的病人逾千万，所以，人体病损组织和器官的修复和替代是一项亟需解决的科学难题，也是本世纪令人瞩目的科学前沿。由于活体组织器官移植存在供体短缺以及免疫排斥风险大等固有弊端，难以成为解决该问题的有效途径。据此，以提高此类疾患治疗水平为目的的组织工程(TissueEngineering)应运而生，组织工程是综合应用生物学、材料学和工程学的原理，在体外构建细胞和材料的三维结构体，通过适当的培养和训练后发展成具有和天然组织类似结构和功能的可移植替代物。由于其重要的科学意义和潜在的经济价值，组织工程一直受到了世界各国的高度重视，在短短不到30年的时间里获得了突飞猛进的发展，并取得了诸多成果。但就其产品的应用领域而言，目前主要集中在结构相对简单的骨组织工程和皮肤组织工程等少数几个领域。究其原因，很重要的一点就是，现有的组织工程结构体的体外构建方法(如电纺丝、3D打印法、溶模法等)难以构建具有天然组织类似的复杂的血管网络结构，而血管又是组织器官生长中必不缺少的部分，可为组织器官生长提供必要的氧气和营养物质，研究表明，只有在血管周围150-200μm范围内的细胞才能够通过弥散作用获得养分和氧气(ColtonC.1mplantableb1hybridartificialorgans.CellTranslant,1955;4:415_436)，缺少复杂的血管网络致使结构体内部的细胞存活率低，因此难以实现大块组织的构建。在组织工程中，常用的构建血管的方法主要有依靠生长因子缓慢释放促进血管形成，多细胞联合培养形成血管结构，利用生物反应器和微流体通道形成血管以及基于先进成型技术的血管化等。[0003]此外，人体是由多种组织和器官组成的结构体，体内的生理过程以及各种组织器官的功能一般都是在神经系统的直接和间接调控下相互进行，孤立的器官不能实现生物学意义上的功能，而且神经系统在人体对体内外环境的变化做出迅速而完善的调整方面起着决定性的作用。所以在体外构建具有特定功能的人体器官时，不可避免地要引入神经系统。同血管分布类似，神经在人体内也是按照多级分支的网状分布。此外，胆管、气管以及尿管等也在人体中起着重要作用，所以在体外构建含有多分支通道的组织器官前体是实现组织器官生物功能的关键一步。[0004]发明专利文献(申请号201110448154.3)提供了一种利用组合模具的分层灌注来成形含多分支血管结构的复杂组织器官前体的方法。该发明将溶液灌注到含有不同直径的中间模具的内外模具之间，交联处理后去除模具即得到组织器官前体。该发明的缺点在于内部血管的结构完全取决于中间模具的结构，因此只能成型结构简单的血管结构，对于构建天然组织中复杂的分支血管网结构无能为力，此外，该方法利用环形中间模具包裹内模具的成型方法，装配操作难度大，拆卸过程中不可避免地损坏已成型的结构体。[0005]发明专利(申请号201210324600.4)提出了一种利用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法。该发明利用非牛顿流体的Weissenbery效应，理论上可制备带多分支血管的纺锤状复杂器官前体，但是该方法的缺点是模具的旋转速度和液体的爬升高度没有明确的定量关系，实际操作时很难确定内环模具的高度，且成形结构单一，只能成形外形是纺锤状的组织器官。此外，每次成形都形成了带锥尖的纺锤体，故成形带多级分支血管结构时，第二级及其以上的内环模具难以定位安装在下一级支点上，此外该方法成形的器官形状只能为单一的纺锤状。【
发明内容】[0006]本发明的目的是提供一种制备带多分支通道的组织器官前体的方法及专用模具，旨在现有工作的基础上，利用专用模具的分层组装办法成形具有分支通道的组织器官，以克服现有技术难以在组织器官内部构建具有复杂分支通道的弊端，同时避免了复杂的装配操作。[0007]本发明的技术方案如下:[0008]—种制备带多分支通道的组织器官前体的专用模具，其特征在于:所述专用模具包括底座模具、至少一级外模具和至少一级内模具；所述底座模具内部为从下至上依次变大的阶梯状，阶梯数和外模具级数相同，底座模具底面为平面、凹面或者凸面，且分布有定位孔；每级外模具上均设有安装孔和灌注口，外模具的外部尺寸和底座模具对应级数的阶梯所围成面的尺寸完全相同，下一级外模具的内腔和上一级外模具的内腔平滑过渡，且外模具的内腔具有和预设组织器官相同的轮廓，多级外模具的灌注口的中心线位于同一直线；每级内模具包括至少一个分支状结构，其数目与对应级外模具的安装孔的数目相同，每个分支状结构包括总支管和分支管，每个分支状结构的总支管与对应级外模具的安装孔形成配合关系，最上级内模具的分支管的数目为1，下一级内模具的总支管尺寸与相邻上一级内模具的分支管尺寸完全相同。[0009]所述的一种制备带多分支通道的组织器官前体的专用模具，其特征在于:所述底座模具和外模具的材料为硬质合成高分子材料或者金属材料；内模具是由无生物毒性材料制成的实心管状，具体材料包括但不局限于合成纤维、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯和聚氨酯。[0010]利用专用模具制备带多分支通道的组织器官前体的方法，其特征在于该方法包括如下步骤:[0011]I)制备质量体积浓度为1%?30%的水凝胶溶液作为基质溶液，提取或购买动物细胞制成细胞悬浮液，细胞悬浮液密度为IX16?5X107个/ml，将基质溶液与细胞悬浮液按体积比I?9:9?I混合制成含细胞的基质溶液，将合成高分子材料溶于有机溶剂中制成质量百分浓度为1%?30%的合成高分子溶液；[0012]2)利用三维打印技术制备专用模具，将第一级内模具的总支管安装在第一级外模具的安装孔上，将第一级外模具套在底座模具的第一级台阶上，第一级内模具分支管安装在底座模具底面的定位孔中，将含细胞的基质溶液从第一级外模具的灌注口倒入模具中，填充实第一级外模具和底座模具间隙后采用物理或化学交联或聚合方法，使模具中含细胞的基质溶液交联，交联完成后依次去除第一级外模具和第一级内模具，形成稳定的第一层细胞基质层，其中含有由第一级内模具所形成的第一级分支通道；[0013]3)将第二级内模具的总支管安装在第二级外模具的安装孔上，将第二级外模具套在底座模具的第二级台阶上，第二级内模具的分支管对准成形完的第一层细胞基质层上的通道，将含细胞的基质溶液从第二级外模具的灌注口倒入模具中，填充实第二级外模具和第一层细胞基质层间隙后采用物理或化学交联或聚合方法，对含细胞的基质溶液进行交联，交联完成后依次去除第二级外模具和第二级内模具，形成稳定带有第二级通道的第二层细胞基质层；[0014]4)重复步骤3)，分别形成第三层至最上层的细胞基质层，得到层间通道相互贯通的带多分支通道的多层细胞基质层；[0015]5)将合成高分子溶液喷洒到所成形的多层细胞基质层表面，经萃取后形成合成高分子层，去除底座模具，即形成带多分支通道的组织器官前体。[0016]所述的带多分支通道的组织器官前体的制备方法，其特征在于:带多分支通道的组织器官前体中的通道在组织器官前体培养过程中形成血管、神经、胆管、气管或尿管。[0017]所述的带多分支通道的组织器官前体的制备方法，其特征在于:将所述通道形成为血管的具体方法为，制备含内皮细胞的基质溶液，成形前先在内模具表面涂敷一层含内皮细胞的基质溶液，采用物理或化学交联或聚合方法，对含内皮细胞的基质溶液进行交联，随后依次喷洒内皮细胞悬浮液和合成高分子溶液，萃取后在内模具表面形成含内皮细胞的基质层-内皮细胞层-合成高分子层三层结构，成形完成细胞基质层小心拔出内模具，将该三层结构留在通道四周。[0018]所述的带多分支通道的组织器官前体的制备方法，其特征在于:将所述通道形成为神经的具体方法为，制备含血旺细胞的基质溶液，直接将含血旺细胞的基质溶液灌注进通道。[0019]所述的带多分支通道的组织器官前体的制备方法，其特征在于:所述的水凝胶为明胶、纤维蛋白原、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸和纤维连接蛋白中的一种或几种。[0020]所述的带多分支通道的组织器官前体的制备方法，其特征在于:所述的合成高分子材料当前第1页1 2 3 4