抗菌肽bf-30在制备治疗或预防血栓性疾病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及抗菌肽BF-30在制备治疗血栓性疾病的 药物及在制备预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品中的新医药用途。
【背景技术】
[0002] 心脑血管疾病是严重威胁人类身体健康的重要疾病之一，血栓的形成是其主要病 因。随着人口的老龄化，其发病率在快速增高。目前临床上用于血栓预防和治疗的药物主要 分为3类，抗血小板的药物、抗凝血的药物和溶解血栓的药物。从天然来源中寻找新的活性 成分，并进而研制新的药物也是当今攻克临床顽疾的重要途径，本发明揭示了抗菌肽BF-30 具有抗血栓作用，以期为寻找新的抗血栓疾病的原料提供科学依据。
[0003] 抗菌肽BF-30是从金环蛇蛇毒中分离得到的活性多肽，含有三十个氨基酸残基， 是一种N端有a -螺旋的直链多肽，等电点为11. 79,其序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨 酸-精氨酸-赖氨酸_亮氨酸_赖氨酸_赖氨酸_丝氨酸_缬氨酸_赖氨酸-赖氨酸-精 氨酸-丙氨酸_赖氨酸_谷氨酸_苯丙氨酸-苯丙氨酸_赖氨酸_赖氨酸_脯氨酸-精氨 酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。BF-30 具有广谱的抗微生物活性，具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏 阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用，其 作用时间迅速，几乎没有溶血活性和细胞毒性。BF-30对革兰氏阴性细菌的活性要强于革兰 氏阳性细菌，此外对白色念珠菌、毕赤酵母和一些腐生性真菌也具有活性。此外，BF-30能 够促进创伤修复，召集炎症细胞到达炎症部位，诱导血管生成，抑制肿瘤生长。
[0004] 本发明研究的抗菌肽BF-30在预防和/或治疗血栓性疾病中的应用，经文献检索， 未见与本发明相同的公开报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供抗菌肽BF-30在预防和/或治疗血栓性疾病中的应用。
[0006] 本发明具体技术方案如下：抗菌肽BF-30及其修饰肽在制备预防和/或治疗血栓 性疾病药物及在制备预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品中的应用，所述抗菌肽BF-30 氨基酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0007] Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Glu Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val lie Gly Val Ser lie Pro Phe (SEQ ID N0：l)〇
[0008] 抗菌肽BF-30的分子量为3637Da。
[0009] 可采用现有技术领域常规方法对抗菌肽BF-30进行修饰得到修饰肽。
[0010] 对于蛋白质和肽类药物，在多数情况下，机体内的氨肽酶及羧肽酶很容易从常见 的直链肽的两端进行逐步的切割分解，使直链肽被降解。多肽修饰是改变肽链主链结构和 侧链基团的重要手段，已有大量文献表明经过修饰后的多肽药物可以显著降低免疫原性、 减少毒副作用、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况等等，明显改善药物 的疗效。
[0011] 多肽类药物常用修饰方法包括主链末端的修饰、中间残基的修饰、环化、氨基酸替 换、糖基化修饰及PEG修饰等。
[0012] PEG修饰可以通过增加多肽分子的相对分子量和空间位阻，提高其对多肽水解酶 的稳定性，减少肾小球的滤过作用。PEG化原理是将PEG末端羟基转化成高反应活性基团， 与蛋白质的巯基、氨基、羧基或是羟基进行偶联反应，生成PEG-蛋白质偶联物。目前，PEG修 饰蛋白质和多肽主要是氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、 N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰等。其中一类是定点修饰，包括N末端修饰和 半胱氨酸残基修饰。N末端修饰通常是通过PEG-醛类修饰剂与一定量的还原剂如氰基硼 氢化钠进行的还原烷化过程；而半胱氨酸残基修饰是利用修饰剂与蛋白质分子的游离巯基 发生反应进行。另一类修饰反应是在蛋白质赖氨酸的e氨基上进行的修饰，反应是随机修 饰，反应迅速，修饰率高。
[0013] 本发明所述修饰肽是在抗菌肽BF-30的N端、C端或中间残基上连接化学基团、氨 基酸、多肽、蛋白质或PEG。优选修饰肽使用PEG与抗菌肽BF-30氨基酸序列中的巯基、氨 基、羧基或羟基发生化学偶联。更优选PEG的相对分子量范围为：5kDa-50kDa。
[0014] 上述抗菌肽BF-30在制备预防和/或治疗血栓性疾病药物中的应用，所述血栓性 疾病是包括急性冠状动脉综合征、心肌梗死、缺血性脑梗死、静脉血栓栓塞等的一系列疾 病。
[0015] 上述制备预防和/或治疗为目的的治疗血栓性疾病的药物含有抗菌肽BF-30及其 修饰肽以及药学上可以接受的载体。药物剂型可为丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水 剂、颗粒剂、注射剂或胶囊。将抗菌肽BF-30作为活性成分与药物学上可接受的载体作为赋 形剂相结合，按照常规方法制成口服给药的内服剂型或非口服给药的注射剂；即可制备成 为治疗冠心病、心绞痛、脑血栓或肺栓塞等疾病的丸剂、散剂、片剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂、 颗粒剂、注射剂等各种剂型的药物。
[0016] 上述预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品含有抗菌肽BF-30及其修饰肽以及 食品学上可接受的赋形剂。所述功能性食品为粉剂、片剂、口服液或胶囊。将抗菌肽BF-30 作为活性成分与食品学上可接受的赋形剂相结合，按照常规方法制成粉剂、片剂、口服液或 胶囊等预防性保健食品或食品添加剂。
[0017] 抗菌肽BF-30可采用化学合成的方法制备得到，本发明使用的抗菌肽BF-30委托 宁波康贝生化有限公司合成得到。
[0018] 本发明所述的抗菌肽BF-30的PEG修饰肽可采用常规方法制备。例如， 1) 优选平均分子量为5kDa的单甲氧基聚乙二醇（MPEG)用三氯化物活化变为所需的修 饰剂TMPEG。 2) 用PBS缓冲液将多肽的浓度调整为100ug/ml，然后将调整好浓度的多肽与过量的 活化的聚合物TMPEG在室温条件下（25°C -40°C )，pH7-9,共价反应2小时（优选温度为 37〇C ) 〇 3) 向反应体系中加入过量的甘氨酸再在同样的温度条件下孵育2小时，以反应除去剩 余的TMPEG。 4) 反应结束后，将整个反应体系保存在4°C条件下备用。 5)纯化时，先将样品用PBS缓冲液按1 : 10的条件稀释，然后将整个反应混合物进行 凝胶渗透层析，所选条件为PBS洗脱的superose-12HR 10/30柱，以每分钟0. 3ml的速度用 PBS洗脱。
[0019] 药理药效实验证实，本发明所述抗菌肽BF-30能抑制血小板聚集，显著延长APTT 时间，具有抗血栓形成活性，能够用于制备预防和/或治疗血栓性疾病的药物；还可应用于 制备预防血栓、抗凝血、降血稠类功能性食品的原料。
【附图说明】
[0020] 图1BF-30对大鼠动静脉旁路中血栓形成的抑制作用，其中thrombusweight为 血栓干重，saline为生理盐水，aspirin为阿司匹林。
[0021] 图2BF-30对小鼠断尾出血时间的影响，其中bleedingtime为出血时间。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只 是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0023] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理 解的含义。
[0024] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0025] 实施例1 :BF_30的体外抗血小板聚集活性
[0026] 1)从江苏省血液中心购买人单采血小板，用改良台氏液对半稀释得富血小板血 衆，再