心脏或血管组织型球体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种心脏及血管组织型球体以及其制造方法。
【背景技术】
[0002]以获得了 2012年的诺贝尔医学、生理学奖的京都大学山中教授的iPS细胞(reprograming)技术为开端，近年来的组织干细胞等的发现、向临床应用的开发、研究非常醒目。以源自干细胞的细胞的临床应用为目标的、分化效率或安全性、纯化的研究等正在世界范围进行，另一方面，由细胞构建组织等并移植的技术的开发也是当务之急。
[0003]作为通过这些技术得到的细胞在临床的利用方法有通过将细胞直接注入脏器、或利用静脉或动脉注射的方法而进行，认为存在生长效率变差等问题(非专利文献I)。另一方面，从1993年开始由Vacanti等提倡组织工程(Tissue Engineering:TE)的概念，提倡利用骨胶原或聚乳酸等的生物体溶解性的支架并构建组织的技术(非专利文献2)。由于该方法使用外来异物作为支架，因此，还有要解决相对于生物体溶解性原料的过敏、感染症等问题的课题。因此，提出了不使用支架而仅用细胞制备组织的技术。
[0004]作为仅用细胞制备功能性的组织的技术，近年来，使用温度感应性片材的方法形成仅用细胞构建的片材，临床应用于以心肌、角膜、食道等作为对象的再生医疗(非专利文献3)。但是，仅用细胞构建组织(例如心肌、血管、软骨、瓣膜等)，使其具有形态学的特征或力学作用方式的技术没有被发现，可以说再生医疗还在开发途中。
[0005]另一方面，作为更接近于生物体的组织形成方法之一，已知有通过作为本来黏着细胞类自然具有的性质即凝集反应所形成的3维细胞形成现象。该现象为在培养黏着细胞类时在培养皿等涂敷黏着抑制物质时，细胞彼此凝集且形成球状的细胞凝集体(称为球体)的现象。作为目前所报道的球体的特征，与利用培养皿或烧瓶目前进行的2维培养进行比较，如下所述在3维的组织构建上具有有利的方面。
[0006]1.可以进行3维地培养，因此，细胞外基质可以在更接近于生物体的环境下产生。
[0007]2.可以通过调节接种的细胞数来调节球体的大小。
[0008]3.可以用微吸量管等进行操作。
[0009]4.可以使球体彼此融合。
[0010]球体可以作为在癌研究或创药研究、组织工程等中主要对单一的细胞进行分析的工具被使用(非专利文献4)。
[0011]为了可以进行理想的临床应用的脏器再生，有必要仅用细胞制备具有高功能(以与生物体相同的方式起作用)的组织。
[0012]现有技术文献
[0013]非专利文献
[0014]非专利文献l:Feng Wang, Jianjun Guan, Cellular card1myoplasty andcardiac tissue engineering for myocardial therapy,Advanced Drug DeliveryReviews 62(2010)784-797
[0015]非专利文南犬 2: Joseph P，Robert Langerj Tissue engineering: the design andfabricat1n of living replacement devices for surgical reconstruct1n andtransplantat1n, Molecular medicine 354，32—34，1999
[0016]非专利文献3:Jun Fujitaj Yuji Itabashij Tomohisa Sekij Myocardialcell sheet therapy and cardiac funct1n.Am J Phys1l Heart Circ Phys1l303:H1169-H1182，2012.
[0017]非专利文献4:Vladimir Mironov,Richard P.Visconti,VladimirKasyanov, Organ printing:Tissue spheroids as building blocks, B1materials30(2009)2164-2174
【发明内容】
[0018]发明所要解决的课题
[0019]本发明的目的在于，提供一种仅用细胞构建心脏组织、血管等的方法。
[0020]用于解决课题的技术方案
[0021]本发明人为了解决上述课题进行了潜心研究，结果，通过使用心肌细胞、内皮细胞及成纤维细胞的混合物，另外，通过使用平滑肌细胞、内皮细胞及成纤维细胞的混合物，分别在制备近似于生物体内的功能的心脏组织及血管组织型球体方面取得成功，直至完成本发明。
[0022]SP，本发明如下所述。
[0023](I)心脏组织型球体，其由心肌细胞和选自血管内皮细胞及成纤维细胞中的至少I种细胞的混合物形成。
[0024](2)如(I)所述的心脏组织型球体，其由心肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的混合物形成。
[0025](3)如⑵所述的心脏组织型球体，其中，心肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的混合比为:相对于心肌细胞100，血管内皮细胞为10?60，成纤维细胞为10?60。
[0026](4)心脏组织型球体，其是由心肌细胞形成的球体和由选自血管内皮细胞及成纤维细胞中的至少I种细胞形成的球体融合而成的。
[0027](5)如(4)所述的心脏组织型球体，其是由心肌细胞形成的球体、由血管内皮细胞形成的球体和由成纤维细胞形成的球体融合而成的。
[0028](6)如(5)所述的心脏组织型球体，其中，源自心肌细胞的球体、源自血管内皮细胞的球体和源自成纤维细胞的球体的存在比为:相对于源自心肌细胞的球体100，源自血管内皮细胞的球体为10?60，源自成纤维细胞的球体为10?60。
[0029](7)心脏组织型立体结构体的制造方法，其包括:对所述(I)?(6)中任一项所述的心脏组织型球体进行配合或叠层。其特征在于，将的心脏组织型球体配合或叠层。
[0030](8)如(7)所述的方法，其中，球体的叠层使用支撑体而进行，所述支撑体具有基板和与该基板大致垂直地配置的丝状体或针状体。
[0031](9)人工心脏组织，其由所述(I)?(6)中任一项所述的心脏组织型球体、或按照
(7)或(8)所述的方法制造的立体结构体构成。
[0032](10)血管组织型球体，其由平滑肌细胞和选自血管内皮细胞及成纤维细胞中的至少I种细胞的混合物形成。
[0033](11)如(10)所述的血管组织型球体，其由平滑肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的混合物形成。
[0034](12)如(11)所述的血管组织型球体，其中，平滑肌细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的混合比为:相对于平滑肌细胞100，血管内皮细胞为10?60，成纤维细胞为10?300。
[0035](13)血管组织型球体，其是由平滑肌细胞形成的球体与选自血管内皮细胞及成纤维细胞中的至少I种细胞形成的球体融合而成的。
[0036](14)如(13)所述的心脏组织型球体，其是由平滑肌细胞形成的球体与由血管内皮细胞形成的球体和由成纤维细胞形成的球体融合而成的。
[0037](15)如(14)所述的血管组织型球体，其中，源自平滑肌细胞的球体、源自血管内皮细胞的球体和源自成纤维细胞的球体的存在比为:相对于源自平滑肌细胞的球体100，源自血管内皮细胞的球体为10?60，源自成纤维细胞的球体为10?300。
[0038](16)血管组织型立体结构体的制造方法，其包括:对所述(10)?(15)中任一项所述的血管组织型球体进行配合或叠层。
[0039](17)如(16)所述的方法，其中，球体的叠层使用支撑体而进行，所述支撑体具有基板和与该基板大致垂直地配置的丝状体或针状体。
[0040](18)人工血管组织，其由通过所述(10)?(15)中任一项所述的血管组织型球体、或按照所述(16)或(17)所述的方法制造的立体结构体构成。
[0041]根据本发明，提供一种心脏及血管组织型球体以及其制造方法。另外，通过对所述球体进行配合或叠层，可以制造心脏组织型或血管组织型立体结构体。通过本发明的方法制造的组织发挥类似于生物体内的功能，可以作为人工心脏组织或人工血管组织使用。因此，本发明在可以用于再生医疗方面是非常有用的。
【附图说明】
[0042]图1是表示心肌细胞单独球体的大小(单位μπι)的图。
[0043]图2是表示由血管平滑肌、血管内皮及成纤维细胞制备的各球体的直径(ym)和细胞数(cells/spheroid)之间的关系(形成第I天)的图。
[0044]图3是表示研究了心肌球体的搏动率和培养液之间的关系而得到的结果的图。
[0045]图4是表示研究了心肌球体的搏动率和培养液之间的关系而得到的结果的图。
[0046]图5是表示各细胞的混合比率中球体的形成的图。
[0047]图6是表示具有3维的血管网的球体的图。
[0048]图7是表示具有3维的血管网的球体的图。
[0049]图8是表示分析了心脏组织型球体的搏动的结果的图。
[0050]图9是表示形成血管网并搏动的血管球体的图。
[0051]图10是将分别单独使用3种细胞而形成的球体发生了融合时的图。
[0052]图11是制备血管补丁组织的图。
[0053]图12是表示对血管补丁组织向心脏的移植试验的图。
[0054]图13是制备血