温晾干胶片，扫描仪 扫描后，用Image J软件分析结果。
[0057] 二、实验结果 1、UVB氧化损伤HaCaT细胞模型的建立 (1)不同剂量UVB照射的HaCaT细胞的存活情况 运用细胞存活率（Cellviability)来评估UVB(100~400mj/cm2)照射对HaCaT细胞存活能力的影响，如图1和表1所示。
[0058]MTT法测定数据分析显示，lOOmJ/cm2组的细胞存活率无明显变化，其他照射组均 随照射后培养时间的延长，细胞存活率先出现不同程度的下降（P〈0. 05)，且均在培养12h 后达最低值。
[0059]UVB照射强度（400mJ/cm2)越高，HaCaT细胞存活率越低（77. 59%)，下降幅度越大， 呈一定的剂量关系。
[0060] 表1不同剂量UVB照射对HaCaT细胞存活率的影响（％)
*尸<0. 05相对于培养时间的对照组 (2)不同剂量UVB照射的HaCaT细胞内ROS水平 荧光酶标仪检测结果显示，200mJ/cm2UVB组有小幅升高，但与对照组相比没有显著 性差异；300~500mJ/cm2UVB照射对HaCaT细胞产生的ROS与对照组相比显著升高，随 着剂量增加ROS产生量逐渐增加，呈剂量依赖性关系（P〈 0. 05)(如图2所示)。
[0061] (3)UVB氧化损伤HaCaT细胞模型的强度筛选 用上述ROS水平和细胞生存率结果做直线回归分析，可认为两者之间有负的直线相关 关系（P<0. 05)，即ROS水平越高，细胞生存率越低(如图3所示)。300mJ/cm2UVB在两 项实验中均显示对HaCaT细胞的影响有统计学意义，可视为UVB致氧化损伤的最小剂量。 因此我们选择300mJ/cm2UVB建立UVB氧化损伤HaCaT细胞模型。
[0062] 2、HaCaT细胞形态学的变化 正常HaCaT细胞形态：倒置显微镜下观察，可见HaCaT细胞贴壁生长，呈上皮细胞型。 其形态为扁平多角形，中央有圆形核。细胞彼此紧密连成单层，生长时呈膜状扩展。传代10 ~12h后贴壁并生长稳定，在传代24~48h后可进入对数生长期。
[0063] (I)HaCaT细胞UVB照射前后形态学改变 正常对照组的HaCaT细胞呈典型上皮样特征，高核浆比例，细胞排列紧密，轮廓清楚折 光好；UVB组细胞联接松散，折光性较对照组差，部分细胞死亡、脱壁(如图4所示)。
[0064] (2)C3G对UVB照射的HaCaT细胞形态学改变 UVB照射的HaCaT细胞变圆、皱缩，悬浮细胞增多，且细胞间彼此分离，排列状态被打 乱。加入C3G组的细胞受到不同程度的修复作用，表现为细胞较对照组排列紧密，肿胀程度 低，轮廓清楚，折光好，细胞碎片减少，细胞损伤程度与C3G剂量呈负相关(如图5所示)。
[0065] 3、C3G对UVB照射的HaCaT细胞存活情况的影响 (1)如表2和图6所示，80ymol/LC3G在UVB照射后12h提高细胞存活率，在照射后 6、24h细胞存活率仍稍高于对照组。160ymol/LC3G在照射后12小时提高细胞存活率。 200ymol/LC3G在UVB照射后6h就增加细胞存活率。说明C3G对UVB照射的HaCaT细 胞有提高存活率的保护作用，且浓度越高，保护作用持续时间越长，保护能力越强。
[0066] 此外，C3G组的生存率随时间降低，而对照组在24h较12h升高。说明HaCaT细 胞在UVB照射后24h内有自我修复能力，细胞存活率较之前升高，但仍低于C3G组。证明 C3G具有有效提高细胞自我修复效率的作用。
[0067] 表2 300mJ/cm2UVB照射和C3G处理后HaCaT细胞的存活率（％)
*尸< 0. 05相对于C3G对照组 (2 ) 300mJ/cm2剂量UVB照射HaCaT细胞后，不同浓度C3G作用于细胞lh，再继续培养 12h后对细胞活性的影响如图7所示。
[0068] 由图7可见，与正常细胞对照组（NC)相比，细胞受到300mj/cm2剂量UVB照射后， 再继续培养12h后，细胞的存活率显著下降（P〈 0.01)。但在加入各组C3G作用Ih时，细 胞的存活率均有所升高。与UVB照射组相比，UVB+ 80、160和200ymol/LC3G的三组可 以显著提高细胞的存活率（P〈 0.01)，所以C3G作用Ih也能够增加被UVB损伤细胞的存活 率。
[0069] 4、C3G对UVB照射的HaCaT细胞内ROS水平的影响 由图8可见，随着C3G浓度的增加，C3G对UVB损伤产生的ROS的清除作用逐渐增强， 且有剂量依赖性。其中，80~200ymol/LC3G作用于UVB照射的HaCaT细胞，细胞内产 生的ROS与对照组相比显著下降，且随剂量增加而减少愈多（P〈 0.05)。
[0070] 5、C3G对UVB照射HaCaT细胞C0X-2及相关蛋白表达的影响 根据上述细胞受照后结果发现UVB照射HaCat细胞12h后细胞的活性最低，因此我 们推测此时细胞受到的损伤最为严重。为得到C0X-2及相关蛋白表达的数据，我们选择用 30〇11^/〇112群8照射他〇3七细胞，然后用浓度为80、160或200 ^111〇1/1〇36或80^111〇1/ L塞来昔布处理lh，并于照射后12h收集细胞。提取蛋白，测蛋白浓度，Westernblot观 察C0X-2、p-EGFR、p-p38等信号强度的变化。
[0071] (1)C3G抑制UVB诱导的C0X-2表达 Westernblot结果显示UVB可以增加HaCaT细胞内C0X-2表达，80~200ymol/L C3G及塞来昔布均可降低C0X-2,但并未见剂量依赖性(如图9所示)。80ymol/LC3G与 80ymol/L塞来昔布抑制C0X-2表达程度差异无统计学意义。
[0072] (2)C3G抑制UVB诱导的EGFR激活 结果如附图10所示，UVB照射明显增加细胞内EGFR的磷酸化，C3G及塞来昔布均可 抑制UVB诱导的p-EGFR激活，但并未见剂量依赖性。此外，80ymol/LC3G降低EGFR磷酸 化的程度明显较80ymol/L塞来昔布强（P〈 0. 05)。
[0073] (3)C3G抑制UVB诱导的HaCaT细胞ERK、p38、JNK和Akt磷酸化 I)C3G对UVB诱导的HaCaT细胞ERK磷酸化的影响 Westernblot结果显示：UVB照射后细胞内p-ERK明显增加，C3G及塞来昔布均可减 少UVB诱导的p-ERK激活，但并未见剂量依赖性。此外，80ymol/LC3G与80ymol/L塞 来昔布比较无统计学意义(如图11所示)。
[0074] 2)C3G对UVB诱导的HaCaT细胞JNK磷酸化的影响 如图12所示，UVB照射后HaCaT细胞内JNK磷酸化增多，C3G及塞来昔布均可抑制UVB诱导的p-JNK激活，但剂量依赖性无统计学意义。此外，80ymol/LC3G降低JNK磷 酸化的程度较80ymol/L塞来昔布弱（P〈 0. 05)。
[0075] 3)C3G对UVB诱导的HaCaT细胞p38磷酸化的影响 如图13所示，UVB照射明显增加细胞内p38的磷酸化，C3G可抑制UVB诱导的p-p38 激活，但并未见剂量依赖性。80ymol/L塞来昔布对照射后的p38磷酸化无明显作用。
[0076] 4)C3G对UVB诱导的HaCaT细胞Akt磷酸化的影响 如图14所示，UVB照射后HaCaT细胞内Akt的磷酸化增多，C3G及塞来昔布均可抑制UVB诱导的p-Akt激活，且呈剂量依赖性（P〈 0.05)，200ymol/LC3G抑制能力最强。此 外，80ymol/LC3G降低Akt磷酸化的程度较80ymol/L塞来昔布弱（P〈0.05)〇
[0077] 综上所述，本实施例的研究利用MTT法、荧光ROS探针实验、Westernblot等技 术检测C3G对UVB氧化损伤HaCaT细胞模型的细胞存活率、ROS水平、C0X-2及其相关蛋 白表达的影响，得出以下结论： (I)UVB照射HaCaT细胞促使ROS生成增多，导致细胞氧化损伤，细胞增殖活性被抑制。
[0078] (2)UVB通过诱导ROS的产生增多，激活EFGR，从而促进ERK、p38、JNK和Akt的磷 酸化，调节C0X-2的表达，推测UVB通过R0S/C0X-2通路造成HaCaT细胞损伤。
[0079] (3)C3G可减少UVB引起HaCaT细胞的ROS生成，保护细胞的增殖活性，减轻氧化 损伤。
[0080] (4)C3G通过降低ROS水平，干预UVB损伤HaCaT细胞的R0S/C0X-2通路，从而 减少C0X-2表达。
[0081] 实施例2C3G对UVB照射后HaCaT细胞的细胞凋亡影响 1、细胞凋亡检测--AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞仪检测AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的原理：在细胞凋亡的早期阶段，位于细胞膜 内侧的磷脂酰丝氨酸（phosphalidylserine,PS)可迀移至细胞膜外侧，而AnnexinV作为 磷脂结合蛋白，对PS具有高度的结合力，因此AnnexinV标记荧光素（FITC)的荧光强度可 以反映早期凋亡的细胞；同时，由于坏死细胞的PS也会暴露于细胞膜外侧，而且对PI高染， 所以结合使用PI拒染法就可以区分凋亡(早期凋亡）和坏死(晚期凋亡）的细胞。在流式细 胞仪分析散点图上，AnnexinV、PI双阴性代表正常活性细胞(左下象限）AnnexinV阳性、 PI阴性代表发生早期凋亡的细胞(右下象限)，Ann