一种负载cq的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及金属纳米材料制备领域，具体涉及一种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]阿尔茨海默病(AD)是一种以记忆和认知功能障碍为主要特征的进行性神经变性疾病。AD多发于老年群体，60岁以上人群中AD的患病率约为5-10%，而在85岁以上人群中AD的患病率高达40-50%。随着人口的老龄化的加剧及缺乏有效的预测与治疗的手段，AD患者数量一直在增加。AD患者的平均生存期仅为5.5年，该病已成为继心脏病、癌症、中风之后，导致老年人死亡的第四大病因。然而，目前已进入临床应用乙酰胆碱酯酶抑制剂及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)只能适度减轻AD症状或减缓认知能力的下降，但却不能终止AD的病理进程。因此，根据AD的发病机理研制新型的抗AD药物具有重大意义。
[0003]AD患者的大脑的主要病理特征为细胞外出现淀粉样蛋白β (Αβ )聚集形成的老年斑及细胞内磷酸化Tau蛋白形成的神经原纤维缠结。Αβ可自发聚集形成折叠片层结构的不可溶纤维，这是A β斑块的主要形态。另一方面，金属离子是诱导A β聚集的重要因素之一。在AD患者脑部Αβ斑块中部分金属离子的浓度显著增加。最新研究发现金属离子如Zn2+和Cu 2+离子在Αβ的聚集和活性氧(ROS)产生并导致AD中的氧化应激中有着重要作用。
[0004]根据以上研究，Αβ聚集被认为是导致神经性退行疾病AD发病的关键。金属螯合剂如氯碘羟喹(CQ)和8-羟基喹啉衍生物(ΡΒΤ2)等在抑制Zn2+和Cu2+离子所诱导的A β聚集和ROS的产生上取得一定的效果，然而大部分的金属螯合剂不能透过血脑屏障(BBB)，即使可以透过ΒΒΒ，这些金属螯合剂对金属离子的螯合不具有选择性，无法区分A β淀粉样蛋白斑块中的有毒金属离子或者正常组织器官中金属酶所含的金属离子。这种不加选择的螯合作用将导致扰乱生物体内正常的生理功能，从而导致一定的毒副作用并阻碍了这些金属离子螯合剂在临床上的应用。为了克服这一缺点及提高药物治疗的有效性，人们设计了具有同Αβ多肽结合及螯合金属离子能力的双功能分子，但是目前没有效的临床证据表明这些双功能分子的治疗有效性。因此，设计合成有效安全的控制释放系统用于负载金属螯合剂进入AD的靶向部位以提高金属螯合的治疗作用并减少其毒副作用仍是十分必要的。
[0005]近年来，纳米载体由于靶向运输、减少药物毒性及可提高药物治疗有效性等特点而受到人们越来越多的关注。目前，人们已设计合成了多种具有很好生物相容性、能在靶向位置控制释放药物的纳米载体，特别是在抗癌研究中。这些有效的控制释放系统中，介孔二氧化硅(MSN)具有大的比表面积和孔容量、表面容易修饰上各种基团、规则的孔道和稳定的骨架结构等优点，非常适合作为药物载体。
[0006]经检索至今未发现有关纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统同时抑制金属离子诱导Αβ多肽聚集及A β多肽自发聚集的报道。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种能够抑制Αβ聚集的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统。
[0008]本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现:
[0009]—种负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统的制备方法，包含如下步骤:
[0010]S1.将介孔二氧化硅MSN进行氨基化修饰得MSN-NH2;再经4-羧基苯硼酸修饰得MSN-BA ；
[0011]S2.将MSN-BA溶于PBS中，超声分散后加入金属螯合剂CQ，搅拌反应12?24h，洗涤得负载CQ的MSN-BA ;
[0012]S3.将负载CQ的MSN-BA溶于PBS中，再加入单糖修饰的AuNPs，搅拌反应12?24h，洗涤得负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs。
[0013]优选地，S1.中所述的MSN-NH2通过如下方法制备得到将MSN溶于有机溶剂中超声分散，随后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，回流反应12?24h，即得MSN-NH2;
[0014]最优选地，MSN-NH^ 3_氨丙基三乙氧基硅烷的用量比为Ig:1?2mL，所述的有机溶剂为无水甲苯；
[0015]优选地，所述的MSN-BA通过如下方法制备得到:将MSN-NH2溶于DMSO中备用，将4-羧基苯硼酸、NHS和EDC溶于DMSO中搅拌反应10?20min，然后加入MSN-NHj^ DMSO溶液，在室温下搅拌反应12?24h，离心、洗涤得经4-羧基苯硼酸修饰得MSN-BA。
[0016]进一步优选地，所述的4-羧基苯硼酸、NHS、EDC和MSN-NH2的用量比为I?2:1?2:1 ?2:3 ?5ο
[0017]最优选地，所述的4-羧基苯硼酸、NHS、EDC和MSN-NH2的用量比为I?2:1:2:4。
[0018]优选地，S2.中MSN-BA与金属螯合剂CQ的用量比为:Ig: 50?10ml ;金属螯合剂CQ的浓度为I?2mM。
[0019]最优选地，S2.中MSN-BA与金属螯合剂CQ的用量比为:lg:50ml ;金属螯合剂CQ的浓度为ImM。
[0020]优选地，S3.中所述的负载CQ的MSN-BA与单糖修饰的AuNPs的摩尔比为1:1?1:6。
[0021]优选地，S3.中所述的负载CQ的MSN-BA与单糖修饰的AuNPs的摩尔比为1:5。
[0022]优选地，S3.中单糖修饰的AuNPs通过如下方法制备得到，将单糖与HAuC14.3H20溶液混合形成均一的水溶液，然后滴加还原剂至溶液变成酒红色即得单糖修饰的AuNPs。
[0023]进一步优选地，所述的单糖为D-葡萄糖、D-半乳糖或D-甘露糖；所述的还原剂为硼氢化钠，所述的单糖与HAuCl4.3H20的摩尔比为1:1?1:6 ;所述HAuCl4.3H20与还原剂的摩尔比为1:1?1:6。
[0024]最优选地，所述的单糖与HAuCl4.3H20的摩尔比为1:1 ;所述HAuCl4.3H20与还原剂的摩尔比为1:1。
[0025]—种由上述制备方法制备得到的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统。
[0026]所述的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统制在备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
[0027]所述的负载CQ的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统制作为A β聚集抑制剂或Αβ纤维化抑制剂的应用。
[0028]有益效果:(I)本发明所述的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs不仅能抑制A β的自发聚集，而且同时具有抑制金属离子所诱导A β多肽聚集的作用；(2)所述的MSN-CQ-AuNPs控制释放系统不仅提高了 CQ在靶向位置释放减少其在血液循环中的过早释放，而且同时所释放的AuNPs协同促进CQ在抑制A β聚集方面的效果；(3)此外，所述的MSN-CQ-AuNPs能有效增加PC12细胞的活性，对细胞起到保护作用，并且能有效降低Αβ纤维对PC12凋亡诱导能力；可以作为一种潜在的治疗阿尔兹海默症的药物。
【附图说明】
[0029]图1是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统MSN-CQ-AuNPs的形貌图；其中A，C为MSN的形貌图；B，D为MSN-CQ-AuNPs的形貌图。
[0030]图2是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统抑制A β的自发聚集及金属离子所诱导Αβ多肽聚集的ThT荧光图。
[0031]图3是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统对铜离子诱导的Αβ 40多肽聚集体神经毒性的抑制作用。
[0032]图4是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统减少铜离子诱导的Αβ 40多肽聚集体对细胞膜的损伤的结果图。
[0033]图5是D-葡萄糖修饰的纳米金封堵介孔二氧化硅控制释放系统抑制铜离子诱导的Αβ40多肽聚集体所引起的神经细胞凋亡的结果图。
【具体实施方式】
[0034]以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
[0035]本发明所用原料的纯度只要达到化学纯以上即可，来源均可从市场购得。
[0036]实施例1 MSN-CQ-AuNPs 的制备
[0037]MSN的制备:将0.1g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶于48mL水中并加入3.5mL0.2M NaOH，待溶液加热到85°C，剧烈搅拌Ih ;随后，逐滴加入0.5mL的正硅酸乙酯(TEOS)，混合溶液再搅拌Ih ;MSN通过离心获得，用乙醇洗涤数遍后离心去除乙醇；MSN在HCl/甲醇中回流24h以去除表面活性剂CTAB ;最后，离心得到的MSN在60°C过夜真空干燥除去介孔中的溶剂。
[0038]MSN-NH2的制备:1.0g MSN溶于80.0mL无水甲苯并超声5min。随后加入1.0mL的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)并回流24h将3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰到MSN表面获得 MSN-NH2。
[0039]MSN-BA的制备:将400mg纯化的MSN-NH2溶于20mL DMS0。0.15g 4-羧基苯硼酸与0.1Og NHS和0.20g EDC在5.0mL DMSO中搅拌反应15min后再加入上述MSN-NH2溶液中。该混合液在室温(25°C )下搅拌反应24h后，离心，沉淀经过DMSO、甲醇及蒸馏水洗涤后得到4-羧基苯硼酸修饰的MSN(MSN-BA)。
[0040]D-葡萄糖修饰的AuNPs制备:200 μ L 0.05Μ HAuCl4.3Η20溶液同50mL D-葡萄糖溶液(0.05M)混合均匀，随后，逐滴滴入600 μ L新鲜制备的0.05M NaBH4溶液。当溶液逐渐变为酒红，得D-葡萄糖修饰的AuNPs。
[0041]MSN-CQ-AuNPs 的制备:
[0042]将10mg MSN-BA溶于PBS并超声5min后同5ml ImM金属螯合剂CQ搅拌24h，离心洗涤数得负载CQ的MSN-BA ;将负载CQ的MSN-BA溶于溶于PBS